亞硝酸鹽(防腐劑、護(hù)色劑)用于肉類制品作發(fā)色劑，肉制品由于使用亞硝酸鹽而呈紅色，亞硝酸鹽也是一種防腐劑，它可抑制微生物的增殖。1967年珀里戈等發(fā)現(xiàn)：僅用亞硝酸鈉時(shí)，100mg／kg才能對(duì)肉毒梭狀芽孢菌起抑制作用，而若用亞硝酸鈉的同時(shí)并加熱，僅需3．5mg／kg即可抑制。硝酸鹽可與2，4一間二甲苯酚或二磺酸酚作用形成黃色化合物，硝酸根可硝化苯形成硝基苯，等等；亞硝酸根可重氮氧化后偶聯(lián)顯色；而亞硝酸根和硝酸根又可經(jīng)氧化、還原互相轉(zhuǎn)化。利用這些性質(zhì)即可進(jìn)行比色法或氣相色譜法等的硝酸鹽或亞硝酸鹽測(cè)定。目前普遍用于食品中痕量測(cè)定的是重氮偶合(格里斯試劑)比色法。
1．原理
樣品經(jīng)去脂肪、蛋白處理后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與氨基苯磺酸重氮化后，再與N—1萘基乙二胺偶合形成紫紅色染料，根據(jù)染料顏色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)比色定量。
2．儀器
①分光光度計(jì)。
②小型絞碎機(jī)。
3．試劑
①亞鐵氰化鉀溶液：稱取10．6g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]，用水溶解并稀釋至100mL。
②乙酸鋅溶液：稱取21．9g乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]溶于少量水中，加入3mL冰乙酸，加水稀釋至100mL。
③飽和硼砂溶液：稱取5g硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)，溶于100mL熱水中，冷卻后備用。
④對(duì)氨基苯磷酸溶液(4g·L-1)：稱取0．4g對(duì)氨基苯磺酸，溶于100mL (1+4)鹽酸中，避光保存。
⑤鹽酸萘乙二胺溶液(2g·L-1)：稱取0．2g鹽酸萘乙二胺，溶于100mL水中，避光保存。
⑥亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取0．1000g亞硝酸鈉(于硅膠干燥器中干燥24h)，加水溶解后移入500mL容量瓶中，并稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于200μg亞硝酸鈉。
⑦亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)貯備液5．00mL。置于200mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于5μg亞硝酸鈉。
4．樣品處理
①肉制品(紅燒類除外)：稱取經(jīng)攪拌混合均勻的樣品5g于50mL燒杯中，加人硼砂飽和溶液12．5mL，以玻璃棒攪和，繼以
②紅燒類：前面部分操作步驟與肉制品相同。取其濾液60mL于100mL容量瓶中，加氫氧化鋁乳液至刻度，過(guò)濾，濾液應(yīng)無(wú)色透明。
③果蔬類：樣品用組織搗碎機(jī)打漿。稱取適量漿液(視試樣中硝酸鹽含量而定，如青刀豆取10g，桃子、菠蘿取30g)，置于500mL容量瓶中。加200mL水，搖勻，再加1.0mL果蔬提取劑(如濾液有白色懸浮物，可適當(dāng)減少)。振搖1h，加2．5mol·L -1氫氧化鈉溶液40mL，用蒸餾水定容后立即過(guò)濾。然后取60mL濾液于100mL容量瓶中，加氫氧化鋁液至刻度。用濾紙過(guò)濾，濾液應(yīng)無(wú)色透明。
5．測(cè)定
①亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液(5μg／mL)0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、l. 0、1．5、2．0、2．5、3．0、4．0和5．0mL (各含0、1、2、3、4、5、7．5、10、12．5、20和25μg亞硝酸鈉)分別加于一組50mL容量瓶中。各加2mL0．4％對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置3～5min后，加人1mL0．2％萘基鹽酸二氨基乙烯溶液，并用重蒸水定容到50mL，搖勻，靜置15min后，于
②亞硝酸鹽的測(cè)定：取40mL濾液于50mL容量瓶中，加入2mL0．4％對(duì)氨基苯磺酸溶液，靜置3～5min后，加人1mL0．2％萘基鹽酸二氨基乙烯溶液，并用重蒸水定容，搖勻，靜置15min。測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的硝酸鈉濃度(μg／mL)，計(jì)算試樣中亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計(jì))的含量。
6．計(jì)算
①X=A/{m*[40/(500*50)]}
式中：X——肉制品中亞硝酸鹽含量，, μg· g -1；
A——測(cè)得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉濃度，μg·mL -1；
m——樣品質(zhì)量，g。
②X=A/{m*(60/500}*[40/(500*50)]}
式中：X——紅燒類和果蔬類中硝酸鹽含量，μg·g-1
A——測(cè)得的吸先度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)皆多亞硝酸鈉濃度，μg·mL-1；
m——樣品質(zhì)量，g。
7．說(shuō)明
硝酸鹽的測(cè)定提要：使硝酸鹽溶液通過(guò)鎘柱，則硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，然后按硝酸鹽的測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)硝酸鹽時(shí)，濾液進(jìn)入鎘桂前，須先以25mL(1：9)稀氨緩沖溶液流洗，其流速可控制在3～5mL／min(簡(jiǎn)易鎘柱前控制在2～3mL／min)。當(dāng)氨液流完后，吸取20mL試樣濾液置于50mL燒杯中，加5啦氨性緩沖溶液，混合后注入貯液漏斗，使流經(jīng)鎘柱還原，以原用燒杯收集流出液。當(dāng)貯液漏斗中樣液流完后，接著加入5mL水置換出柱內(nèi)留存的樣液。如前將全部收集液流進(jìn)鎘柱再還原一次：。堞二次流出液收集于100mL容量瓶中，繼以重蒸水流經(jīng)鎘柱洗滌3次，每次20mL。洗滌液一并收集于同一容量瓶中，用重蒸水定容至刻度。搖勻，取出10~40mL(視濾液中含亞硝酸鹽量而定)于50mL容量瓶中；如前進(jìn)行顯色和測(cè)定，可求得樣品中經(jīng)還原后亞硝酸鹽總含量，減除原有的亞硝酸鹽含量。
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