一、體液總蛋白
體液總蛋白包括數(shù)量眾多的各種蛋白質(zhì)，在進(jìn)行定量測定時作了如下假定：①所有蛋白質(zhì)都是單純的多肽鏈，糖脂類和金屬有機(jī)物等均不計在內(nèi)，其含氮量平均為16％；②各種蛋白質(zhì)理化性質(zhì)雖不同，但與化學(xué)試劑的反應(yīng)性一致。顯然，這過于理想化，因此任何一種化學(xué)方法測定體液總蛋白，均存在一定的缺陷。測定蛋白質(zhì)一般利用蛋白質(zhì)特有的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)：①重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)；②分子中均含有氮原子；③與色素結(jié)合的能力；④沉淀后借濁度或光折射測定；⑤酪氨酸和色氨酸殘基對酚試劑反應(yīng)或被紫外光吸收。臨床實(shí)驗(yàn)室利用以上原理測定體液蛋白質(zhì)的方法有多種，各種方法性能和應(yīng)用情況不同，最常用的是雙縮脲法，以下將重點(diǎn)介紹。
(一)雙縮脲法
【檢測原理】蛋白質(zhì)中的兩個相鄰肽鍵(一CO—NH一)在堿性溶液中能與二價銅離子( )作用產(chǎn)生穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)與雙縮脲(H：N—Oc—NH—CO—NH：，為兩個尿素分子縮合而成)在堿性溶液中與 作用形成紫紅色的反應(yīng)相似，因此，將蛋白質(zhì)與堿性銅反應(yīng)的方法稱為雙縮脲法(biuretmethod)。
【參考區(qū)間】血漿總蛋白隨年齡增大有所增高，60歲后則稍有下降。新生兒為46～ 70g／L，數(shù)月齡到2歲為51～75g／L，3歲及以上為60~80g／L，成人為64～83g／L(直立行走) 和60~78g／L(臥床)。
【臨床意義】血漿總蛋白濃度下降常由白蛋白濃度下降引起；濃度增高主要見于慢性炎癥等多克隆免疫球蛋白增多，以及漿細(xì)胞病的單克隆免疫球蛋白增多癥。
【評價】
1·特異性 因至少含兩個-CO -NH - 基團(tuán)才能與絡(luò)合，故氨基酸及二肽無反應(yīng)，三肽以上才能反應(yīng)。體液小分子肽含量極低，對蛋白質(zhì)來說可忽略不計。
2呈色一致性 因呈色強(qiáng)度與肽鍵數(shù)量即蛋白質(zhì)含量成正比，因此各種蛋白質(zhì)呈色強(qiáng)度基本相同，在目前所有總蛋白測定方法中最好。
3-臨床應(yīng)用 本法檢測范圍為10～120g／L，靈敏度不高，但很適合血清總蛋白濃度測定，絕大多數(shù)正常和病理血清總蛋白均在其檢測范圍內(nèi)。雙縮脲法測定胸腹水總蛋白的檢測低限為0．47g／L，生物檢測限為1．33g／L，胸腹腔積液總蛋白多數(shù)在4．5～50g／L，因此能采用該法測定。對蛋白質(zhì)濃度很低的腦脊液和尿液，該法不是合適的定量方法。
(二)測定體液總蛋白的其他方法
1·染料結(jié)合法在酸性環(huán)境下，蛋白質(zhì)帶正電荷，可與染料陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生顏色改變，常用染料有氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)、鄰苯三酚紅鉬等。前兩種常作為血白蛋白電泳的染料?？捡R斯亮藍(lán)常用于需更高呈色靈敏度的蛋白電泳中，也可用于尿液、腦脊液等樣品的蛋白質(zhì)定量測定，優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速、靈敏，但比色杯對染料有吸附作用，在自動生化分析儀中無法很好地清洗(手工清洗常采用乙醇)。染料結(jié)合法均存在不同蛋白質(zhì)與染料結(jié)合力不一致的問題。
1、目前臨床上最常用的是鄰苯三酚紅鉬(pyrogallol red molybdate，PRM)法。其原理是：在酸性介質(zhì)中，鄰苯三酚紅一鉬酸鹽與樣品中的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使其最大吸收峰從467nm轉(zhuǎn)移至594nm，在600nm處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法靈敏度高，檢測下限為l0~20mg／L，多數(shù)試劑盒的檢測上限約為2g／L。試劑不吸附比色杯，可用于自動生化分析儀中。不足之處仍然是試劑與各種蛋白質(zhì)的呈色程度不同，球蛋白約為白蛋白的70％。試劑中加入適量的十二烷基磺酸鈉，可使球蛋白反應(yīng)性有所升高。該法適用于蛋白質(zhì)濃度低的尿液、腦脊液等。
2、凱氏定氮法(Kjeldahl method)該法于1883年建立，是經(jīng)典的蛋白質(zhì)測定方法。其原理是：測定樣品中的含氮量，推算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中含氮量較為恒定，平均16％，即lg氮相當(dāng)于6．25g蛋白質(zhì)。含氮化合物用硫酸加熱分解，在有催化劑存在的條件下，生成硫酸銨，后者再與濃堿作用生成NHOH，采用蒸餾法將氨蒸餾并被硼酸吸收，將硼酸銨用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的消耗量可算出總氮量，再折算成蛋白質(zhì)含量。該法定量準(zhǔn)確性好，精密度高，靈敏度高，并適用于任何形態(tài)的樣品測定，至今仍被認(rèn)為是測定許多生物樣品中蛋白質(zhì)含量的參考方法。但該法操作復(fù)雜、費(fèi)時，不適合臨床常規(guī)測定。樣品中各種蛋白質(zhì)含氮量有少許差異，尤其在疾病狀態(tài)下差異可能更大。對于非蛋白含氮化合物較高的血清樣品，則還要測定無蛋白血濾液中非蛋白氮含量并將其扣除。
3、比濁法(turbidimetry) 某些酸如三氯乙酸、磺基水楊酸等能與蛋白質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生微細(xì)沉淀，由此產(chǎn)生的懸浮液濁度大小與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高，可用于測定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì)濃度較低的樣品；缺點(diǎn)是影響濁度大小的因素較多，包括加入試劑的手法、混勻技術(shù)、反應(yīng)溫度等，且各種蛋白質(zhì)形成的濁度亦有較大的差別。目前臨床上較多應(yīng)用的是芐乙氯銨法，其原理是：芐乙氯銨在堿性條件下與蛋白質(zhì)形成沉淀，其懸浮液穩(wěn)定，可在660nm處進(jìn)行濁度測定。該法是比濁法中較好的方法，其靈敏度、準(zhǔn)確度以及對白蛋白和球蛋白的反應(yīng)一致性都優(yōu)于其他比濁法，檢測范圍較廣，可用于自動化分析，然而其精密度仍不夠理想。
4、酚試劑法(phenol reagent method) 由Folin于1921年首創(chuàng)，早期用于酪氨酸和色氨酸測定，后由吳憲開始用于蛋白質(zhì)定量。酚試劑法的原理是運(yùn)用蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸使磷鎢酸和磷鉬酸還原為鎢藍(lán)和鉬藍(lán)。該法靈敏度較高。Lowry將酚試劑法進(jìn)行了改良，先用堿性銅溶液與蛋白質(zhì)反應(yīng)，再將銅．肽鍵絡(luò)合物中的酪氨酸和色氨酸與酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生最大吸收在745～750nm的顏色，使呈色靈敏度更為提高，達(dá)到雙縮脲法的100倍左右，有利于檢出較微量的蛋白質(zhì)。各種蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，如白蛋白含色氨酸0．2％，而球蛋白含色氨酸2％～3％，因此本法不適合測定混合蛋白質(zhì)，只適合測定單一蛋白質(zhì)，如測定組織中某一蛋白質(zhì)抽提物。該法易受還原性化合物的干擾，如帶一SH的化合物、糖類、酚類等。
5、直接紫外吸收法根據(jù)蛋白質(zhì)分子在280nm或215／225nm的紫外吸光度值計算蛋白質(zhì)含量。其原理是：芳香族氨基酸在280nm處有一吸收峰，可用于蛋白質(zhì)的測定。因生物樣品常混有核酸，核酸最大吸收峰為260nm，在280nm也有較強(qiáng)的光吸收，因而測得的蛋白質(zhì)濃度可采用兩個波長的吸光度予以校正，即蛋白質(zhì)濃度(g/L)： 該法準(zhǔn)確性受蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸的含量影響甚大，而且尿酸和膽紅素在280nm附近有干擾，所以不適合血清、尿液等組成復(fù)雜的體液蛋白質(zhì)測定，常用于較純的酶、免疫球蛋白等測定。本法不加任何試劑且不需要處理，可保留制劑的生物活性，可回收全部蛋白質(zhì)。
二、體液白蛋白
【檢測方法】體液白蛋白濃度的測定方法包括電泳法、免疫化學(xué)法和染料結(jié)合法。電泳法只能測定其百分含量，乘以總蛋白濃度可得其濃度，用于白蛋白定量操作不方便，且精密度不如直接定量。免疫化學(xué)法包括免疫比濁法和放射免疫法等，這類方法特異性好、靈敏度高，且白蛋白易純化，因而其抗血清容易制備，較適合于尿液和腦脊液等低濃度白蛋白的測定。血清中白蛋白濃度很高，以染料結(jié)合法最多用，其原理是：陰離子染料溴甲酚綠(bromcresol green，BcG)或溴甲酚紫(bromcresol purpie，BCP)能與白蛋白結(jié)合，其最大吸收峰發(fā)生轉(zhuǎn)移，BcG與白蛋白反應(yīng)形成的藍(lán)綠色復(fù)合物在630nm處有吸收峰，BcP與白蛋白反應(yīng)形成的綠色復(fù)合物在603nm處有吸收峰。而球蛋白基本不結(jié)合這些染料。
【參考區(qū)間】血清白蛋白隨年齡有所變化，0～4天為28～44g／L4天～14歲為38～54g／L，此后下降；成人為35～52g／L。，>60歲為32～46g／L。走動者比臥床者平均高3g／L。醫(yī)學(xué)決定水平：>35g／L。時正常，28～34g／L為輕度缺乏，21～27g／L。為中度缺乏，<2lg／L。則嚴(yán)重缺乏。低于28g／I。時，會出現(xiàn)組織水腫。
【臨床意義】血漿白蛋白增高僅見于嚴(yán)重脫水時，無重要的臨床意義。低白蛋白血癥見于下列疾病。
注：華南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)-國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購平臺
