一、目視比色法
用眼睛觀察比較被測(cè)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的深淺，以確定被測(cè)物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。
1．目視比色法的原理
人的眼睛不能直接測(cè)量有色溶液的吸光度，只能比較兩個(gè)同色溶液的顏色深淺，即透過光的強(qiáng)度。設(shè)照射光的強(qiáng)度為I0，透過標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測(cè)溶液后的光強(qiáng)度分別為I標(biāo)和I試，根據(jù)朗伯一比耳定律可得：
lg I0/I標(biāo) =k標(biāo)·c標(biāo)·b標(biāo)
lg I0/I試 =k試·c試·b試
當(dāng)溶液顏色深淺相同時(shí)，I標(biāo)=I試，則：
k標(biāo)·c標(biāo)·b標(biāo)=k試·c試·b試
因同種有色溶液和同種入射光的k標(biāo)=k試，液層厚度相同，即b標(biāo)＝b試，所以才有：c標(biāo)＝c試。
2．目視比色法的方法
常用的目視比色法是標(biāo)準(zhǔn)系列法。這種方法是用一套同種材料制成的、形狀大小完全相同的奈氏比色管（容量有10、25、50、100mL等數(shù)種），將一系列不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入各比色管中，再分別加入相同體積的顯色劑和其他試劑。然后稀釋至同一刻度，這樣便配制成一套顏色由淺到深的標(biāo)準(zhǔn)色階。另取一支相同的比色管，加入一定量被測(cè)溶液，在同樣條件下顯色，并稀釋至刻度，從管口垂直向下觀察，比較被測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)色階的顏色。若被測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)色階中某一溶液的顏色深度相同，說明兩者濃度相同；若被測(cè)溶液顏色介于標(biāo)準(zhǔn)色階中某兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，則被測(cè)溶液的濃度介于兩標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，可取二標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值作為被測(cè)組分的濃度。
3．目視比色法的優(yōu)缺點(diǎn)
目視比色法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適宜于大批試樣分析，測(cè)定靈敏度相對(duì)較高，由于比色管中液層較厚，對(duì)于顏色較淺的有色溶液也可進(jìn)行測(cè)定，而且可在自然光（復(fù)合光）條件下進(jìn)行測(cè)定，可以測(cè)定不符合朗伯—比耳定律的有色溶液，這些都是本方法的優(yōu)點(diǎn)。其缺點(diǎn)是用眼睛觀察顏色，主觀誤差較大，因而準(zhǔn)確度不高。相對(duì)誤差可達(dá)50％~20％。另外，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液比較費(fèi)時(shí)，有些有色溶液的顏色不能保持持久，常需臨時(shí)配制。
二、分光光度法
1．分光光度法的特點(diǎn)
分光光度法是用棱鏡或光柵作為分光器，并用狹縫分出波長(zhǎng)范圍很窄的一束光，通過有色溶液后，測(cè)量透過光的強(qiáng)度，以求出被測(cè)物質(zhì)含量的方法。由于分光光度法通過溶液的光束接近單色，雜光減少了。因此，分光光度法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。分光光度法還可以在一個(gè)試樣中同時(shí)測(cè)定兩種以上的組分，而不需要分離。
2.測(cè)定方法
①工作曲線法。又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線法。它需要配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下顯色。然后使用相同厚度的比色皿，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)作圖繪出“工作曲線”。若有色溶液遵守朗伯一比耳定律，工作曲線應(yīng)為一條過原點(diǎn)的直線。用相同方法，在相同條件配制待測(cè)溶液，并測(cè)出其吸光度Ax，根據(jù)Ax可在工作曲線上查出待測(cè)液的濃度Cx。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法適于批量試樣的分析。
②標(biāo)準(zhǔn)比較法。用此法測(cè)定時(shí)，首先需配制合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（Cs）和待測(cè)溶液（Cx）。在相同條件下顯色并且測(cè)定兩溶液的吸光度As和Ax。由于是同種物質(zhì)的溶液，據(jù)朗伯一比耳定律可得：
Ax/As=Cx/Cs
Cx=Ax/As×Cs
用比較法測(cè)定時(shí)，所用標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度應(yīng)接近待測(cè)溶液的濃度，否則可能產(chǎn)生較大誤差。
3．分光光度計(jì)的主要部件
分光光度計(jì)有多種型號(hào)，但儀器的結(jié)構(gòu)基本相似，都有光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和讀數(shù)顯示器等主要部件組成。
儀器各個(gè)部件的性能和構(gòu)造隨著所適用的波長(zhǎng)區(qū)域和數(shù)據(jù)精度要求不同而不同，然而每一組成部分的作用是相同的，現(xiàn)分別介紹如下：
①光源。最常用的可見光光源為6-12V的低壓鎢絲燈泡，光的波長(zhǎng)為320~2500nm。為了獲得較穩(wěn)定的輻射強(qiáng)度，電源電壓常用穩(wěn)壓器穩(wěn)壓，光路上裝有聚光鏡以把光變成一束平行光。
②單色器。在分光光度計(jì)中采用棱鏡或光柵以及狹縫構(gòu)成的單色器來獲得純度較高的單色光。單色器是將光源發(fā)生的連續(xù)光譜按波長(zhǎng)順序分散成單色光的裝置。
當(dāng)光通過入射狹縫，經(jīng)過透鏡以一定角度射到棱鏡上，在棱鏡的兩界面上發(fā)生折射而色散。色散了的光被聚集在一個(gè)微微彎曲并帶有出射狹縫的表面上，移動(dòng)棱鏡或移動(dòng)出射狹縫的位置，就可使所需波長(zhǎng)的光通過狹縫照到試液上。
狹縫對(duì)于單色器的質(zhì)量有重大影響。狹縫愈小，出射譜帶愈窄，單色光的純度愈高，但光強(qiáng)度減弱。因此，必須調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)莫M縫寬度，以獲取純度較高、強(qiáng)度足夠的單色光。
③吸收池。吸收池也稱比色皿，一般分光光度法都配有各種厚度的比色皿，有1、2、3和5cm等。比色皿一般為長(zhǎng)方體形，是由無色透明、厚度均勻、耐腐蝕的光學(xué)玻璃或石英玻璃制成。同一套比色皿的厚度必須相同，彼此之間的透光率相差極?。ㄐ∮?.5%)，使用比色皿時(shí)應(yīng)注意保護(hù)透光面，勿使磨損產(chǎn)生斑痕，以免影響透光率。
④檢測(cè)器。檢測(cè)器是測(cè)量光線通過溶液以后光強(qiáng)度變化的裝置，它是利用光電效應(yīng)把透過光強(qiáng)度變?yōu)殡娪嵦?hào)的變換器，是分光光度計(jì)的關(guān)鍵部件。常用的檢測(cè)器有光電池、光電管和光倍增管等。
光電管是一種二極管，在玻璃或石英泡內(nèi)固定兩個(gè)電極，陽極通常是一鎳片，陰極為涂有一層光敏物質(zhì)（如氧化艷）的金屬片，光敏物質(zhì)受光照射時(shí)可以放出電子。當(dāng)光電管的兩極與電池相連時(shí)，由陰極放出的電子將在電場(chǎng)作用下流向陽極，形成光電流，光電流的大小與照射在它上面的光強(qiáng)度成正比。由于光電管產(chǎn)生的光電流很小，需要用放大裝置將其放大后才能測(cè)量。
⑤檢流計(jì)。光電池或光電管產(chǎn)生的光電流的大小，是通過檢流計(jì)反映出來的。檢流計(jì)的標(biāo)尺上有兩種刻度，一種是等分的百分透光率（T％)，另一種是非等分刻度的吸光度（A)。
4．分光光度計(jì)
分光光度計(jì)種類很多，根據(jù)工作波長(zhǎng)范圍來分類可分為可見分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)和紅外分光光度計(jì)。紅外分光光度計(jì)主要用于結(jié)構(gòu)分析，紫外可見分光光度計(jì)主要用于無機(jī)物和有機(jī)物含量的測(cè)定。在光度分析中一般使用的可見分光光度計(jì)有國(guó)產(chǎn)721型和722型。
①721型分光光度計(jì)。該儀器是在72型分光光度計(jì)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)的可見分光光度計(jì)，其波長(zhǎng)范圍為360~800nm。它將磁飽和穩(wěn)壓器、單色器和檢流計(jì)幾個(gè)部件合裝成一體，搬運(yùn)方便，有利于操作。儀器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有改進(jìn)，其測(cè)光系統(tǒng)是由光電管和晶體管組成的光電流放大線路，測(cè)定的靈敏度、準(zhǔn)確度和再現(xiàn)性都較好。
由光源1發(fā)出光，射到聚光鏡2上聚集后照射到平面反射鏡7上，轉(zhuǎn)角900反射進(jìn)入狹縫6，由此入射到單色器內(nèi)。狹縫正好位于球面準(zhǔn)光鏡4的焦面上，當(dāng)入射光經(jīng)過準(zhǔn)光鏡后，就以一束平行光射向棱鏡3。光線進(jìn)入棱鏡后，就在其中色散，色散后的光被平面鏡反射，依原路稍拐一個(gè)角度返回，途經(jīng)聚光鏡8后進(jìn)入光電管12，產(chǎn)生相應(yīng)的光電流，經(jīng)過放大器13，在微安表14上讀出。
②722型分光光度計(jì)。722型分光光度計(jì)是在721型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)而成的分光光度計(jì)。721型采用棱鏡自準(zhǔn)式光路，而722型則采用光柵自準(zhǔn)式色散系統(tǒng)和單光束結(jié)構(gòu)光路，光電轉(zhuǎn)換元件也為光電管。另外，722型分光光度計(jì)晶體管放大器采用對(duì)數(shù)放大器，讀數(shù)結(jié)構(gòu)從721型的電表（透光率、吸光度）直讀式改為數(shù)字（透光率、吸光度、濃度）直讀式，測(cè)定的靈敏度更高，讀數(shù)誤差更小。
