【實(shí)驗(yàn)器材】
(1)儀器注射器、離心機(jī)、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、燒杯、磁力攪拌器、容量瓶、滅菌過(guò)濾器、移液器及配套槍頭、吸管、彎鑷等。
(2)材料相關(guān)動(dòng)物、濾紙、稱(chēng)量紙、濾膜。
(3)試劑NaOH、Hank’s液、新鮮制備的三蒸水、乳蛋白粉、雞胚、牛心、碘酒、酒精、胰酶、HCl、酵母浸膏、醋酸等。
【操作方法與步驟】
(一)血清的制備和使用
1．血清的制備
(1)用乙醚等麻醉動(dòng)物，從動(dòng)物體表大的靜脈或動(dòng)脈用注射器直接抽血采集血液，或解剖出動(dòng)脈或心臟再抽血，然后立即注入無(wú)菌管中。
(2)室溫靜置，待凝血堅(jiān)實(shí)血清析出后，吸出上清液，3000～4000r／min離心；然后再分離一次上清液，即可應(yīng)用。
(3)制備中一切操作如不能做到完全無(wú)菌，則最終血清尚須通過(guò)0．22μm微孔濾膜濾過(guò)除菌。
(4)血清是比較黏稠液體，濾過(guò)緩慢，比較麻煩。因此操作中要保證做到無(wú)菌才好。
2．血清的熱滅活
(1)選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)。
(2)對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入與血清等體積的水。
(3)溫度預(yù)試：對(duì)照瓶?jī)?nèi)插入2～3支經(jīng)挑選的溫度計(jì)(保證測(cè)試溫度的準(zhǔn)確性)，放入水浴箱中，接通電源，調(diào)節(jié)溫度控制鈕，使溫度計(jì)所示溫度保持在56℃。
(4)血清滅活：血清瓶與帶溫度計(jì)的對(duì)照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計(jì)所示溫度上升至56℃時(shí)，定時(shí)30min。
(5)大瓶血清滅活后，進(jìn)行分裝。
（6)分裝后，抽樣做無(wú)菌試驗(yàn)，一70～一20℃保存。
注意：滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過(guò)滅活也會(huì)損失一些對(duì)細(xì)胞有利的成分，如生長(zhǎng)因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認(rèn)血清中不含補(bǔ)體成分。對(duì)于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。
3．血清的使用
(1)血清使用時(shí)，首先要觀察血清的顏色和清亮度，若顏色偏紅，或色淺，或出現(xiàn)沉淀，表示血清質(zhì)差或變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)更換。
(2)若使用凍融后的血清，其最上層無(wú)色透明，活力最差，使用前應(yīng)將其搖勻。
(3)血清反復(fù)凍融使用，其效價(jià)下降又容易污染。
(4)長(zhǎng)時(shí)間凍存的血清，一旦凍融后出現(xiàn)沉淀物(此物抑制細(xì)胞生長(zhǎng))，應(yīng)棄去。
(5)若有條件，先購(gòu)買(mǎi)少量幾種批號(hào)血清，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞克隆率檢查，從而篩選出質(zhì)量好的血清。
(6)為了使整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，以便前后比較，應(yīng)使用同一批號(hào)血清。
(7)血清使用濃度一般為5％～20％，最常用的是10％。
(8)血清使用過(guò)多，容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無(wú)限細(xì)胞系，迅速生長(zhǎng)之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
4．血清的保存
需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于一70～一20℃低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切勿超過(guò)1個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約l0％，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽?。切勿將血清?7℃放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì)破壞而影響血清質(zhì)量。
5．血清的解凍
采用逐步解凍的方法。
(1)一70～一20℃低溫冰箱中保存的血清放人4℃冰箱中溶解1d。
(2)然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。
(3)在溶解過(guò)程中需不斷輕輕搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。
(4)切勿直接將血清從一20℃進(jìn)入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。
(二)0．5％水解乳蛋白制備和使用
(1)稱(chēng)量：稱(chēng)0．5g水解乳蛋白粉入燒杯中，加少許滅菌Hank’s液調(diào)成糊狀。
(2)溶解：補(bǔ)加Hank’s液至i00mL，不斷攪拌，令充分溶解，置室溫1～2h，并不時(shí)攪拌；然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。
(3)濾過(guò)：濾紙濾過(guò)，分裝入瓶中。
(4)滅菌：10磅10min高壓蒸汽滅菌后，4℃冰箱保存。
(5)使用：與合成培養(yǎng)基按照體積比1：1混合使用。
(三)胚胎浸出液的制備
1．雞胚浸出液
(1)孵化：選健康受精雞胚，置入37℃溫箱孵化；箱內(nèi)置有水皿，以保持箱內(nèi)濕度，每日翻動(dòng)胚一次(180。)。
(2)處理：孵育至9～12d，取出雞胚置小燒杯中，令氣室端向上，用碘酒和酒精消毒蛋殼。
(3)取胚：用消毒剪剪除氣室端蛋殼，小心撥開(kāi)尿囊膜，用彎玻棒或彎鑷伸到胚體頸下方，輕輕挑起雞胚置入平皿中。
(4)清理：去掉胚眼、血塊、尿囊膜等物；用BSS沖洗雞胚。
(5)粉碎：置入燒杯中用剪刀剪碎胚體后，再用組織研磨器研磨；或放入20～50mL注射器中(無(wú)針頭)直接壓擠入無(wú)菌小燒杯中。
(6)浸出：加入等量的Hank’s液，用吸管輕輕吹打均勻，密封后置37℃溫箱中30min。
(7)分離：3000r／min，離心30min，無(wú)菌取上清液分裝入小瓶中，一20℃保存；用前再離心一次，取上清液使用；全部操作過(guò)程要保持無(wú)菌，要剔除尿囊膜和胚眼等，以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良作用。
2．牛心肌浸出液
該浸液主要用作支原體檢查。制備方法如下：
(1)新鮮牛心用蒸餾水洗兩次，切開(kāi)除去內(nèi)膜、脂肪及結(jié)締組織等，用絞肉機(jī)將心肌絞碎，稱(chēng)取250g加雙蒸水900mL，加NaCl5g，放入三角燒瓶?jī)?nèi)。
(2)56℃水浴加溫10~20min，再加入胰酶2．5g，待胰酶全部溶解后用NaOH調(diào)節(jié)pH至8．0，以增強(qiáng)消化能力，于56℃消化2h，并不斷攪拌，保持pH8．0左右。
(3)將心肌消化懸液用HCI調(diào)至pH6．0左右，煮沸5～10min，再用四層紗布濾去肉渣，略加壓力將肉汁擠出，將浸出液加雙蒸水至1000mL。
(4)加酵母浸膏1g攪拌之，調(diào)pH至8．0再煮5min，四層紗布(中間墊一層脫脂棉)過(guò)濾，再用濾紙過(guò)濾，pH保持在8．0，即成牛的心肌浸液，115℃、15min高壓滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?
(四)鼠尾膠原的制備與使用
1．鼠尾膠原的制備方法
(1)配制0．1%醋酸溶液，10磅10min高壓滅菌備用。
(2)取組織：取體重250g左右大白鼠一只，從尾根部切斷鼠尾，置75％酒精中浸泡30min；無(wú)菌條件下將鼠尾切成1．5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿中。
(3)溶解：取1．5g剪碎尾腱浸入150mL0．1%醋酸溶液，置4℃冰箱中，并不時(shí)搖動(dòng)，48h后，移入滅菌離心管中。
(4)分離：以4000r／min離心30min(最好在4℃條件)，吸取上清液，l0磅10min高壓滅菌后分裝入小瓶中，20℃冰箱保存。
(5)殘?jiān)稍偌?0mL醋酸液作用24h后，離心收集保存。
2．使用方法
(1)用吸管吸少許膠原涂于滅菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁培養(yǎng)面上，不宜太厚，以?xún)A斜瓶時(shí)不流動(dòng)為準(zhǔn)。
(2)向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)通以氨氣后封上瓶蓋；或用浸有氨水的棉球堵塞瓶口(或不用氨氣處理，而是置37℃溫箱過(guò)夜；或置室溫48h，再用無(wú)菌蒸餾水沖洗晾干亦可)后置滅菌飯盒內(nèi)。
(3)作用30min，待膠原凝固。
(4)用無(wú)菌生理鹽水或BSS液或基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液洗滌膠原面后，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡過(guò)夜，37℃干燥備用。
