氨氮對(duì)牙鲆幼魚(yú)肝中超氧化物歧化酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的影響
葉繼丹,王琨,常建波
(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,水產(chǎn)生物技術(shù)研究所,福建廈門(mén)361021)
摘要:本實(shí)驗(yàn)研究了短期內(nèi)不同氨氮(NH4-N)濃度(1~4 mg·L-1)暴露對(duì)牙鲆幼魚(yú)肝 組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量的影響。結(jié)果 表明,在本實(shí)驗(yàn)劑量及實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi),牙鲆肝組織中SOD活性隨暴露濃度的增加及時(shí) 間的延長(zhǎng)而升高,表現(xiàn)為明顯的誘導(dǎo)效應(yīng);NH4-N對(duì)牙鲆肝組織中MDA含量變化沒(méi)有 明顯的影響。
關(guān)鍵詞:氨氮;牙鲆;超氧化物歧化酶;脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物
中圖分類(lèi)號(hào):Q953 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
NH4-N始終是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中必須面對(duì)的一種重要環(huán)境因子,長(zhǎng)期以來(lái)一直受到養(yǎng) 殖者的普遍重視。有關(guān)NH4-N對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖影響的研究很多,迄今為止,國(guó)內(nèi)外已就 NH4-N對(duì)不同發(fā)育時(shí)期水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的毒性作用及其安全劑量進(jìn)行了大量研究[1~5],提 出了適合于不同水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖水體對(duì)NH4-N的要求及其防治對(duì)策[6, 7]。NH4-N中毒 后水產(chǎn)動(dòng)物可出現(xiàn)組織糖原減少、血漿葡萄糖、乳酸鹽水平升高等糖代謝改變[8, 9]、離子 滲透性降低和離子流通量減少等細(xì)胞滲透性改變[10]。
這些生理變化會(huì)因不同的研究對(duì) 象而存在一定差異,反映出水產(chǎn)動(dòng)物種類(lèi)存在NH4-N耐受性差異[11, 12]。最近的一些資 料顯示,NH4-N可以通過(guò)降低水產(chǎn)動(dòng)物抗病力而發(fā)揮毒性作用,如降低這些動(dòng)物體內(nèi)的 細(xì)胞吞噬活性、抗菌活力等[13, 14],進(jìn)一步的研究證實(shí),NH4-N還可直接影響與水產(chǎn)養(yǎng)殖 動(dòng)物抗病力相關(guān)的代謝酶的活性(如溶菌酶、酚氧化酶、抗氧化酶等),使它們發(fā)生相應(yīng)升 高或降低的變化[15~17]。
牙鲆(paralichthys olivaceus)是我國(guó)的重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi),目前未見(jiàn)有 關(guān)NH4-N對(duì)牙鲆抗氧化酶系統(tǒng)影響的報(bào)道。本文就不同濃度NH4-N脅迫對(duì)牙鲆幼魚(yú) 肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)含量的影響進(jìn)行了 測(cè)定,旨在初步探討NH4-N對(duì)牙鲆產(chǎn)生毒害的可能機(jī)制,為制定養(yǎng)殖水體NH4-N安全 指標(biāo)及抗逆營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供參考。
1 材料與方法
1. 1試劑及儀器
NH4Cl為AR級(jí); SOD、MDA測(cè)定試劑盒為南京建成生物工程研究所出品。
1. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
牙鲆幼魚(yú),體重(25±3)g,體長(zhǎng)(13±2)cm,由福建省東山縣夏鐵牙鲆魚(yú)苗場(chǎng)提供。 實(shí)驗(yàn)魚(yú)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室水族箱內(nèi)暫養(yǎng),水源為二級(jí)砂濾海水,用鼓風(fēng)機(jī)經(jīng)氣石持續(xù)充氣,日換 水一次, 7d后分組,實(shí)驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)分配于各個(gè)玻璃水族箱(70 cm×40 cm×40 cm)中,實(shí)驗(yàn) 水體積為70L,每箱放魚(yú)15尾,每組設(shè)平行組, 3d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
1. 3實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)NH4-N質(zhì)量濃度梯度,用NH4Cl調(diào)節(jié)NH4-N水平,使其終濃度分別為 0、1、2、3和4 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)期為7d,其間不喂食,日換水1/2,各箱加注的新水為NH4Cl 調(diào)節(jié)到相應(yīng)氨氮質(zhì)量濃度的海水,持續(xù)充氣,每箱用水泵作自體循環(huán)過(guò)濾,光照制度為 12L∶12D。實(shí)驗(yàn)水溫為23. 4~24. 6℃。實(shí)驗(yàn)期間無(wú)牙鲆死亡現(xiàn)象發(fā)生。
1. 3實(shí)驗(yàn)樣品采集
在實(shí)驗(yàn)的3d、5d、7d時(shí),分別從各組中隨機(jī)取出5尾魚(yú),經(jīng)MS222麻醉后逐尾取出 肝組織,分別裝袋, -80℃下保存?zhèn)溆谩?nbsp;
1. 4實(shí)驗(yàn)樣品分析
肝組織樣品在4℃下解凍,剪碎,按1∶9的重量體積比(W /V)加入預(yù)冷生理鹽水,然 后用PT~1200CL高速組織勻漿機(jī)勻漿(15 000r·min-1, 2min)。勻漿液經(jīng)低溫離心 (10000r·min-1, 10min)后,取上清液備用。測(cè)定SOD活性時(shí)上清液稀釋至1%。 SOD活性、MDA值分別按SOD試劑盒(黃嘌呤氧化酶法)、MDA試劑盒(TBA法)的 操作步驟進(jìn)行測(cè)定。SOD活性單位定義為:在37℃條件下,每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng) 液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)亞硝酸鹽單位NU·(mg prot)-1。 MDA單位為nmol (mg prot)-1。
按Folin~phenol試劑法[18]測(cè)定1%組織勻漿液蛋白含量, 10%的組織勻漿液蛋白含 量用1%的組織勻漿液蛋白含量乘以10計(jì)算。
1. 5數(shù)據(jù)處理
用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均 值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。
2 結(jié)果與討論
NH4-N在水體中以離子氨(NH4+)和分子氨(NH3)的形式存在,二者處于動(dòng)態(tài)平衡。 NH4-N對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒性實(shí)際上是由NH3引起的[1, 19],NH3毒性隨養(yǎng)殖水體溫度和pH 的變化而變化[2, 6]。在其它養(yǎng)殖水體環(huán)境條件不變的情況下,水溫越高,毒性越大[2]。由 于牙鲆的生態(tài)習(xí)性與大菱鲆極為相似,其生理特性也可能十分相近,按Kumlu等人[2]計(jì) 算NH3濃度的方法,本實(shí)驗(yàn)條件下最大NH4-N濃度所對(duì)應(yīng)的分子NH3濃度約為0. 31 mg·L-1,Person-LeRuyet等人[20]在慢性毒性實(shí)驗(yàn)下測(cè)定的大菱鲆(14g)的安全濃度 為0. 3 mg·L-1,這與本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的牙鲆最大NH3暴露濃度接近,但本實(shí)驗(yàn)水溫卻比后者 高7℃左右,在此溫度下,該NH4-N濃度應(yīng)該超出牙鲆的安全濃度,不過(guò),NH4-N暴露實(shí) 驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)牙鲆可見(jiàn)中毒反應(yīng)。
以往的研究表明,不同的環(huán)境毒性物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)上的不同而表現(xiàn)出對(duì)動(dòng)物的毒作用 方式及機(jī)制存在很大的差異,但越來(lái)越多的研究表明,自由基代謝失衡引起組織細(xì)胞發(fā)生 氧化損傷是許多有毒物質(zhì)產(chǎn)生毒性效應(yīng)的一種共同機(jī)制,而抗氧化酶系統(tǒng)在維持氧自由 基代謝平衡方面起著十分重要的作用[23]。
SOD活性可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的 能力,而MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物中的一種,其含量則可以間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的 程度。在低濃度下,毒物誘導(dǎo)機(jī)體組織SOD活性,而在高濃度下則抑制SOD活性[24]。 本實(shí)驗(yàn)表明,NH4-N暴露對(duì)牙鲆幼魚(yú)肝組織中SOD活性產(chǎn)生明顯的影響,結(jié)果見(jiàn)圖 1。暴露3d時(shí), 1、2和3mg·L-1NH4-N濃度組SOD活性雖有升高,但均與對(duì)照組差異不 顯著(P>0. 05),僅4 mg·L-1NH4-N濃度組SOD活性明顯高于1 mg·L-1濃度組和對(duì) 照組(P<0. 05)。
暴露5d時(shí),除1mg·L-1NH4-N濃度組SOD活性與對(duì)照組差異不明顯 (P>0. 05),其它三個(gè)NH4-N濃度組SOD活性明顯升高(P<0. 01)。暴露7d時(shí),各 NH4-N濃度組SOD活性變化情況與暴露5d時(shí)的相似。從表1中的結(jié)果可知,NH4~N暴 露對(duì)牙鲆幼魚(yú)肝組織中MDA含量沒(méi)有明顯的影響(P>0. 05)。由此可以看出,在本實(shí)驗(yàn) 條件下,牙鲆幼魚(yú)肝組織SOD活性隨著NH4-N暴露濃度增加而升高,且隨著暴露時(shí)間的 延長(zhǎng),活性隨之升高,是由低濃度NH4-N的持續(xù)刺激所致,與前面NH4-N濃度分析的結(jié) 果相符,而且,肝組織中MDA含量也沒(méi)有發(fā)生顯著升高現(xiàn)象。
Chetty等人[15]檢測(cè)了一種 淡水蚌在亞致死NH4-N濃度(46. 7 mg·L-1)下經(jīng)7d暴露后的肝胰臟SOD活性和MDA 含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn), SOD活性被誘導(dǎo),而MDA含量沒(méi)有明顯變化,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由 此說(shuō)明,在低濃度NH4-N的刺激作用下,牙鲆肝組織活性可被大量誘導(dǎo),以清除隨后產(chǎn) 生的大量氧自由基,使得肝組織中MDA生成量沒(méi)有明顯增加,減緩了機(jī)體組織細(xì)胞的脂 質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)程,從而避免了機(jī)體的氧化損傷。
這種情況與樊甄姣等人[17]觀察到的低濃度 NH4-N(5 mg·L-1)使扇貝血清活性氧增加, SOD活性升高的現(xiàn)象類(lèi)似。從1 mg·L-1質(zhì) 量濃度的NH4-N暴露對(duì)牙鲆抗氧化酶活性沒(méi)有明顯影響結(jié)果可以看出,在短期內(nèi)該 NH4-N濃度對(duì)牙鲆是安全的。
3 結(jié)論
在本實(shí)驗(yàn)條件下,牙鲆幼魚(yú)SOD活性明顯受NH4-N暴露濃度及其作用時(shí)間的影響, 并隨暴露濃度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,但均屬于應(yīng)激性升高現(xiàn)象,但 NH4-N的短時(shí)間暴露不會(huì)導(dǎo)致牙鲆幼魚(yú)的應(yīng)激損傷。
參 考 文 獻(xiàn)：略
來(lái)源：中國(guó)化學(xué)試劑網(wǎng)
