l.原理
樣品經(jīng)脫水后，用環(huán)己烷在脂肪抽提器中抽提，或經(jīng)皂化后抽提；提取液經(jīng)液一液分配后，再經(jīng)柱層析純化、濃縮；濃縮液在乙酰化紙上點(diǎn)樣、展開、分離出的B(a)P在紫外光(波長365 nm或波長254 nm)下照射產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn)，然后溶出熒光物質(zhì)，用熒光分光光度計(jì)檢測其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長386 nm、發(fā)射波長405 nm)，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。
2.儀器 熒光分光光度計(jì)及紫外燈(波長365 nm)。
3.試劑
①環(huán)己烷(重蒸)。
②二氯甲烷(重蒸)。
③苯(重蒸)。
④醋酸酐。
⑤濃H2SO4。
⑥KOH。
⑦無水Na2SO4。
⑧硅膠(60-1100目)。
⑨中性Al203(100~200目)，經(jīng)130℃活化4 h。
⑩B(a)P標(biāo)準(zhǔn)貯存液[100 μgB(a)P／mL]：準(zhǔn)確稱取純品苯B(a)P 10.o mg，用環(huán)己烷溶解并定容至100 mL。
?B(a)P標(biāo)準(zhǔn)溶液：1μgB(a)P／mL。
?乙?；嚰埖闹苽洌簩游鲇脼V紙裁成5 cm×20 cm紙條，浸入盛有300 mL苯、260 mL醋酸酐和0.2 mL濃H：SO。的層析缸中，不斷攪拌4 h后，過夜，取出紙條在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，用蒸餾水洗2-13次晾干后，放人無水乙醇中浸泡4 h，取出晾干壓平。
4.樣品前處理
①稱取樣品50 g于三角燒瓶中，加95％乙醇100 mL，KOH 12 g，裝上冷凝管，于水浴(95℃)加熱回流3 h，取下三角燒瓶，樣液濾入裝有100 mL水的分液漏斗中。
②依次用乙醇50 mL、環(huán)己烷150 mL分兩次洗三角燒瓶，過濾后一并收于分液漏斗中，振搖3 min，靜置分層，下層液放于第二只分液漏斗中，再用環(huán)己烷70 mL提取3 min，分層后，棄水層。
③環(huán)己烷提取液合并于第一只分液漏斗中，用環(huán)己烷8 mL，淋洗漏斗，洗液一并收入。用40℃100 mL水洗環(huán)己烷提取液3次，水洗液合并于第二只分液漏斗中，用環(huán)己烷30 mL提取1次，振搖1 min，分層后棄水層。再用40℃水50 mL重復(fù)一次。
④全部環(huán)己烷提取液經(jīng)層析柱純化，用100 mL苯淋洗層析柱，流速2 mL／min。洗脫液用K—D濃縮器濃縮至0.1-10.5 mL，待檢。
5.紙層析
①點(diǎn)樣：在乙?；癁V紙一端5 cm處，用鉛筆劃一橫線，用微量注射器吸取樣品濃縮液(10-150／uL)，同時點(diǎn)B(a)P標(biāo)準(zhǔn)溶液(1ug·mL-1)20uL。
②展開：將點(diǎn)樣后的乙酰化紙上端掛在圓柱形層析缸缸蓋的掛鉤上，層析缸內(nèi)加30 mL無水乙醇、5 mL二氯甲烷為展開劑，紙的下端浸入溶劑約l cm，在避光處展開，待展開劑前沿上升到距紙頂l cm時取出晾干。重復(fù)操作2~3次。
③紫外燈下照射：取展開后的乙?；堄谧贤鉄?波長365 nm)下照射，用鉛筆圈出B(a)P標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相應(yīng)位置的熒光帶，用剪刀剪下圈內(nèi)的這一部分，并剪成小碎片，放人具塞小試管中，準(zhǔn)確加5 mL苯，蓋緊后于60℃水浴加熱20 min，在其間搖勻2次，冷卻待檢。
6.熒光測定
①定性分析：將檢測液移人石英杯中，置于熒光分光光度計(jì)上，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，將激發(fā)波長固定在386 nm，對檢測液和標(biāo)準(zhǔn)液分別在發(fā)射波長400~500 nm間掃描，繪出發(fā)射光譜圖(圖20—5)，再將發(fā)射波長固定在405 nm，激發(fā)波長于250~400 Flm間掃描，繪出激發(fā)光譜圖(圖20一6)。如兩者圖譜相同，就確認(rèn)為苯并(a)芘。
②定量分析：將激發(fā)波長固定在386 13.m，分別測定405 nm、400 nm、410 nm處測定液和標(biāo)準(zhǔn)液的熒光強(qiáng)度，然后用基線法求出在405 nm處的峰高值LI = I405-1/2(I400+I410)，利用定點(diǎn)直線比較法計(jì)算測定樣品中B(a)P含量。
Y = I1/I0×Y0×1000/m
式中：Y——待檢液B(a)P含量，μg/kg；
Y0——標(biāo)準(zhǔn)液B(a)P含量，μg/kg；
I1——檢測液的熒光強(qiáng)度；
m——樣品質(zhì)量，g。
7.說明
①熟肉制品試樣處理應(yīng)先加水30 mL和KOH 12 g，放置30 min后再加乙醇100 ml。
②用40℃溫水洗環(huán)己烷提取液時，第一次輕搖15次，第二次輕搖30次，最后振搖1 min，避免劇烈振搖，防止乳化。
③層析柱下端放少量脫脂棉，先裝入10 g硅膠，后裝3 g中性A120。，裝時注意使裝好的柱中沒有氣泡。層析柱中也可填人硅鎂型吸附劑(60-1100目)。該試劑處理參照黃曲霉毒素檢測的高效液相色譜法。
④于脂肪提取器中放人脫脂藥棉，用環(huán)己烷浸泡，在水浴上經(jīng)抽提4h以上，取出晾干。
⑤也可采用薄層層析法來檢測。在硅膠G薄層板上點(diǎn)不同系列標(biāo)準(zhǔn)液與待測液，然后用異辛烷展開3次，取出，在暗處稍晾干，置紫外光燈下(波長365 nm)觀察，分別劃出所有熒光部分，再分別刮下后各加95％乙醇5 mL，振搖離心后，分別取上清液于熒光分光光度計(jì)下，用激發(fā)波長386 nm檢測，標(biāo)準(zhǔn)系列根據(jù)熒光波長406 nm處測得的峰高值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣液根據(jù)熒光波長406 nm處的峰高值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得苯并(a)芘的含量。
