一、目的和內(nèi)容
目的：學(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法,學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù).
內(nèi)容：
1．用稀釋法分離細(xì)菌、放線菌和霉菌.
2．用平板劃線方法分離微生物.
3．學(xué)習(xí)斜面接種及穿刺接種等無(wú)菌操作技術(shù).
二、材料和用具
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜面菌種.
牛肉膏、高氏1號(hào)、土豆蔗糖固體培養(yǎng)基各1瓶,49.5mL無(wú)菌水(帶玻璃珠)1瓶,4.5mL無(wú)菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.
無(wú)菌培養(yǎng)皿12套,1mL無(wú)菌移液管10支,土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.
三、操作步驟
(一)土壤稀釋分離：
1、取土壤：取表層以下5—10cm處的土樣,放入無(wú)菌的袋中備用,或放在4℃冰箱中暫存.
2、制備稀釋液(要無(wú)菌操作)
(1)制備土壤懸液：
稱土樣0.5g,迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無(wú)菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力最好),振蕩5～10min,使土樣充分打散,即成為10-2的土壤懸液.
(2)稀釋：
用無(wú)菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL,放入4.5mL無(wú)菌水中即為10-3稀釋液,如此重復(fù),可依次制成10-3～10-8的稀釋液(圖 3-1).注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面,每一個(gè)稀釋度換用一支移液管,每次吸入土液后,要將移液管插入液面,吹吸3次,每次吸上的液面要高于前一次,以 減少稀釋中的誤差.
3、混菌法測(cè)定菌落數(shù)的方法
(1)細(xì)菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL,分別接人相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中,每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿.然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基,分別倒入以上培養(yǎng)皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5～2mm為宜),迅速輕輕搖動(dòng)平皿,使菌液與培 養(yǎng)基充分混勻,但不沾濕皿的邊緣,待瓊脂凝固即成細(xì)菌平板.倒平板時(shí)要注意無(wú)菌操作.
(2)放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液,在每管中加入10%酚液5～6滴,搖勻,靜置片刻,然后分別從兩管中吸出1mL加入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中,選用高氏1號(hào)培養(yǎng)基,用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中,便可制成放線菌平板.
(3)霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL,分別接入相應(yīng)標(biāo)號(hào)的平皿中,每個(gè)稀釋度接兩個(gè)平皿.在融化的土豆蔗糖培養(yǎng)基中,每100mL加入滅菌的乳酸1mL,輕輕搖勻,然后用與細(xì)菌相同的方法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板.
4、培養(yǎng)：將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置,即皿蓋朝下放置,于28～30℃中恒溫培養(yǎng),細(xì)菌培養(yǎng)1～2d,放線菌培養(yǎng)5～7d,霉菌培養(yǎng)3～5d.觀察生長(zhǎng)的菌落,用于進(jìn)一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面.
(二)平板制作及劃線分離方法：
1．倒平板：按無(wú)菌操作要求,在火焰旁操作,做法如3(1).
2．劃線分離：使用接種環(huán),從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣,在相應(yīng)培養(yǎng)基平板中劃線分離,劃線的方法多樣,目的是獲得單個(gè)菌落,.
(三)斜面接種和穿刺接種：
1．斜面接種
(1)取新鮮固體斜面培養(yǎng)基,分別做好標(biāo)記(寫上菌名、接種日期、接種人等),然后用無(wú)菌操作方法,把待接菌種接入以上新鮮培養(yǎng)基斜面上.
(2)接種的方法是,用接種環(huán)沾取少量待接菌種,然后在新鮮斜面上“之”字形劃線,方向是從下部開始,一直劃至上部(圖3—4A).注意劃線要輕,不可把培養(yǎng)基劃破.
(3)接種后30℃ 恒溫培養(yǎng),細(xì)菌培養(yǎng)48h,放線菌、霉菌培養(yǎng)至孢子成熟方可取出保存.
2．穿刺接種
(1)取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養(yǎng)基,做好標(biāo)記(寫上菌名)、接種日期,接種人等).
(2)接種的方法是,用接種針沾取少量待接菌種,然后從柱狀培養(yǎng)基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要移動(dòng).
(3)接種后30℃恒溫培養(yǎng), 24h后觀察,比較兩種菌的生長(zhǎng)結(jié)果.
四、注意事項(xiàng)
1．一般土壤中,細(xì)菌最多,放線菌及霉菌次之,而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中,故從土壤中分離細(xì)菌時(shí),要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計(jì)數(shù).
2．在土壤稀釋分離操作中,每稀釋10倍,最好更換一次移液管,使計(jì)數(shù)準(zhǔn)確.
3．放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多.
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
記錄土壤稀釋分離結(jié)果,并計(jì)算出每克土壤中的細(xì)菌、放線菌和霉菌的數(shù)量.
計(jì)算方法：選擇長(zhǎng)出菌落數(shù)30～300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù),按以下公式：
總菌數(shù)/g=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)
