1.前言
海水無機氮是海洋植物生長所必須的營養(yǎng)元素。但當其含量過高時，與水中其它營養(yǎng)鹽類共同作用便可能引起水體富營養(yǎng)化。而富營養(yǎng)化的水體，水生植物便會大量繁殖，消耗水中的溶解氧，破壞海洋生態(tài)環(huán)境，進而引發(fā)赤潮,造成海洋災(zāi)難。盡管赤潮的形成是多種環(huán)境因素的共同作用，但營養(yǎng)鹽是導(dǎo)致赤潮發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。海水的富營養(yǎng)化和適宜的營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)是引發(fā)赤潮的主要因素。解決赤潮的根本途徑是減少沿海工業(yè)、生活污水的排放，但短期內(nèi)這一目標難以達到，只能加強對赤潮的預(yù)報。由于赤潮的發(fā)生與營養(yǎng)鹽存在著密切關(guān)系，海水營養(yǎng)鹽的監(jiān)測便尤為重要。無機氮（包氨氮、硝氮、亞硝氮）是海水營養(yǎng)鹽監(jiān)測中的重要項目。因此海水無機氮測定方法的研究對海洋環(huán)境監(jiān)測具有重要意義。
氨氮是水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的主要指標之一。測定水環(huán)境中氨氮的含量對控制水環(huán)境質(zhì)量有著非常重要的意義。氨氮的傳統(tǒng)測定方法主要有納氏試劑分光光度法、次溴酸鈉氧化法、靛酚藍分光光度法[2]。
2.材料和方法
2.1海水樣品
海水樣品的采集按照《GB 12763.4-2007海洋調(diào)查規(guī)范 海水化學(xué)要素觀測》的要求進行。海水水樣采自中國近海。
2.2傳統(tǒng)方法的測定
亞硝酸鹽采用萘乙二胺分光光度法測定。硝酸鹽采用鎘柱還原法測定。氨采用靛酚藍分光光度法。以上方法均為《GB 17378.4-2007海洋監(jiān)測規(guī)范 第四部分：海水分析》中測定氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽的仲裁方法。
2.3流動注射分析儀測定
采用《近岸海域環(huán)境監(jiān)測規(guī)范 HJ 442-2008》附錄G和附錄H中的流動注射自動光度法分別測定海水水樣中的氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽。
3.實驗部分
3.1萘乙二胺分光光度法測定亞硝態(tài)氮[11]
3.1.1儀器工具
風(fēng)光光度計、容量瓶、量筒、25ml比色管、燒杯、棕色試劑瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸氣球、玻璃棒、天平
3.1.2主要化學(xué)試劑
磺胺、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉
3.2.3溶液的配制
磺胺溶液（10g/L）:稱取1.0g磺胺溶于70ml鹽酸溶液（1+6），用水稀釋至100ml，盛于棕色試劑瓶中。
鹽酸萘乙二胺溶液（1.0g /L）:稱取0.1g鹽酸萘乙二胺，溶于100ml水中，盛于棕色試劑瓶中。
3.1.3分析步驟
先繪制標準曲線，取7個25ml具塞比色管，分別移入0、0.25ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml亞硝酸鹽標準使用溶液，加水至標線，混勻。各加入1.0ml磺胺溶液，混勻，放置5min后再各加入1.0ml鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，放置15min。選543nm波長，使用1cm比色皿，以水做參比測定吸光值A(chǔ)i。水樣的測定步驟與標準曲線測定步驟相同。
3.2鎘柱還原法測定硝態(tài)氮[12]
3.2.1儀器工具
風(fēng)光光度計、容量瓶、量筒、錐形分液漏斗、50ml比色管、燒杯、棕色試劑瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸氣球、玻璃棒、天平、PH試紙
3.2.2主要化學(xué)試劑
碘胺、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、硝酸鉀、氯化銨
3.2.3溶液配制
氯化銨緩沖溶液：稱取10g氯化銨溶于1000ml水中，用約1.5ml氨水調(diào)節(jié)PH至8.5。
磺胺溶液（10g/L）:稱取1.0g磺胺溶于70ml鹽酸溶液（1+6），用水稀釋至100ml，盛于棕色試劑瓶中。
鹽酸萘乙二胺溶液（1.0g /L）:稱取0.1g鹽酸萘乙二胺，溶于100ml水中，盛于棕色試劑瓶中。
3.2.4分析步驟
先繪制標準曲線，取7個100ml比色管，分別加入0、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml硝酸鹽標準使用溶液，加水至50ml至標線，混勻。各加入50ml氯化銨緩沖溶液，混勻。將混合溶液逐個倒入還原柱中約30ml，直至溶液接近鎘屑上部界面，棄去流出液，重復(fù)上述操作，接取25ml流出液于50ml比色管中，用水稀釋至50ml，混勻。各加入1.0ml磺胺溶液，混勻，放置2min。再各加入1.0ml鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，放置20min。在543 nm波長下使用1cm比色皿，以水做參比測定吸光值A(chǔ)i。水樣的測定步驟與標準曲線測定步驟相同。
3.3 靛酚藍分光光度法測定氨[13]
3.3.1儀器工具
風(fēng)光光度計、容量瓶、量筒、錐形分液漏斗、 25ml比色管、燒杯、棕色試劑瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸氣球、玻璃棒、天平、電熱爐
3.3.2主要化學(xué)試劑
檸檬酸鈉、氫氧化鈉、苯酚、亞硝酰鐵氰化鈉、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、次氯酸鈉溶液
3.3.3溶液的配制
檸檬酸鈉溶液（480g/L）:稱取240g檸檬酸鈉，溶于500ml水中，加入20ml氫氧化鈉溶液，加入防爆沸石，煮沸除氨，至溶液體積小于500ml。冷卻后用水稀釋至500ml，盛于聚乙烯瓶中。
氫氧化鈉溶液：稱取10g氫氧化鈉，溶于1000ml水中，加熱蒸發(fā)至500ml，置于聚乙烯瓶中。
苯酚溶液：稱取1.9g苯酚和20mg呀硝酰基鐵氰化鈉溶于少量水中，稀釋至1000ml，混勻，盛于棕色試劑瓶中。
次氯酸鈉使用溶液：用氫氧化鈉使用溶液稀釋一定量的次氯酸鈉溶液，使其1.0ml 中含1.5g有效氯。
硫代硫酸鈉溶液：稱取25g硫代硫酸鈉，溶于少量水中，稀釋至1000ml，加1g碳酸鈉，混勻。置于棕色瓶中。
3.3.4分析步驟
先繪制標準曲線，取6個25ml比色管，分別加入0、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml銨標準使用溶液，加水至標線，混勻。各加入1.0ml檸檬酸鈉溶液，混勻。再加入1.0ml苯酚溶液，混勻。再加入1.0ml次氯酸鈉使用溶液，混勻，放置6h以上，在640nm波長下，使用3cm比色皿，以水做參比測定吸光值A(chǔ)i。水樣的測定步驟與標準曲線測定步驟相同。
3.4流動注射自動光度法測定硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮
3.4.1儀器工具
QUAATRO流動注射儀、鎘還原柱、容量瓶、量筒、比色管、燒杯、棕色試劑瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸氣球、玻璃棒、天平、樣品杯
3.4.2主要化學(xué)試劑
磺胺、磺胺、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、硝酸鉀、Brij表面活性劑、硫酸銅
3.4.3 溶液的配制
磺胺儲備溶液：溶解10.0g磺胺至1L10%的鹽酸溶液中。
硝酸鹽儲備溶液（100mg N/L）：在1L的容量瓶中預(yù)先加800ml純水，溶解0.7217g亞硝酸鈉，用純水稀釋至標線，用聚乙烯瓶儲存。
亞硝酸鹽儲備溶液（100mg N/L）：在1L的容量瓶中預(yù)先加800ml純水，溶解0.4928g亞硝酸鈉，用純水稀釋至標線，用聚乙烯瓶儲存。
Brij-35初始溶液：在1000ml純水中加入2ml Brij表面活性劑。
磺胺溶液：取200ml磺胺儲備液加入1ml Brij-35溶液。
鹽酸萘乙二胺溶液：將1.0g鹽酸萘乙二胺溶于1L純水中。
硫酸銅溶液：將20g硫酸銅溶解于1L純水中。
3.4.4分析步驟
測定前，冰凍的樣品先在室溫下解凍，配制好所有的試劑和標準溶液。開啟QUAATRO流動注射儀，預(yù)熱30min。根據(jù)分析亞硝酸鹽或硝酸鹽的類型設(shè)置分析通道，設(shè)置分光光度計的波長為550nm。根據(jù)樣品中亞硝酸鹽或硝酸鹽最高濃度設(shè)定合適量程。加入試劑到進樣通道，直至基線穩(wěn)定。準備好干凈的樣品杯，將標準曲線系列溶液、分析的樣品、實驗室試劑空白、實驗室基體加標樣和質(zhì)控樣分別放置進樣盤內(nèi)進行分析測定。分析結(jié)束后，泵入純水清洗所有試劑管路。
3.5流動注射自動光度法測定氨氮
3.5.1儀器工具
容量瓶、比色管、燒杯、棕色試劑瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸氣球、玻璃棒、天平、樣品杯、QUAATRO流動注射儀
3.5.2主要化學(xué)試劑
檸檬酸鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、硫酸銨、氯仿、亞硝酰鐵氰化鈉、苯酚、二氯異氰脲酸鈉鹽
3.5.3溶液配制
絡(luò)合劑儲備液：溶解140g二水合檸檬酸鈉、5.0g氫氧化鈉、10.0g乙二胺四乙酸至800ml純水中，混勻，稀釋至1L。
硫酸銨儲備液（100mlN/L）：稱量0.4721g硫酸銨，轉(zhuǎn)移至含800ml純水的容量瓶中，溶解后加幾滴氯仿，定容至1L，置于玻璃瓶中。
亞硝酰鐵氰化鈉溶液：溶解0.25g亞硝酰鐵氰化鈉于400ml純水中，稀釋至500ml，置于棕色瓶中。
苯酚溶液：溶解1.8g固體苯酚和1.5g氫氧化鈉于1L水中。
次氯酸鈉溶液：溶解0.5g氫氧化鈉和0.2g二氯異氰脲酸鈉鹽于1L純水中。
3.5.4分析步驟
測定前，冰凍的樣品先在室溫下解凍，準備好所有的試劑和標準溶液。開啟QUAATRO流動注射儀，預(yù)熱30min。調(diào)整分析流程和泵管，調(diào)整分光光度計的波長為660nm，打開燈。選擇合適的載流，泵入純水至基線穩(wěn)定后，加入試劑到進樣通道，直至試劑基線穩(wěn)定。準備好干凈的樣品杯，將標準曲線系列溶液、分析的樣品、實驗室試劑空白、實驗室基體加標樣和質(zhì)控樣分別放入進樣盤內(nèi)進行分析測定。分析結(jié)束后，泵入純水清洗所有試劑管路。
以上所用試劑均為分析純，水為去離子水。
4.計算
4.1An的計算
An=Ai-A0,Ai為風(fēng)光光度計測定的空白以外的吸光值，A0為空白的吸光值。
4.2樣品濃度的計算
傳統(tǒng)方法中的計算均利用Excel軟件。萘乙二胺分光光度法和靛酚藍分光光度法的計算利用過程中標準曲線的繪制均以扣除空白后的吸光值為橫坐標，濃度為縱坐標,得到線性回歸方程c(mg/L)=aAn+b，c為樣品的濃度，An為扣除空白后的吸光值，a為標準曲線斜率，b為標準曲線截距。將樣品所測的吸光值，扣除空白后帶入上述線性回歸方程，即可得到樣品濃度。鎘柱還原法的計算過程中得到的線性回歸方程為c總(mg/L)=aAn+b， c總為亞硝酸鹽和硝酸鹽的總濃度，An為扣除空白后的吸光值，a為標準曲線斜率，b為標準曲線截距。因此將樣品所測的吸光值，扣除空白后帶入線性回歸方程，得到的是亞硝酸鹽和硝酸鹽的總濃度。
流動注射自動光度法樣品濃度的計算通過標準曲線的回歸方程求得，其中標準系列點的濃度為自變量，相關(guān)的響應(yīng)峰值為應(yīng)變量。
4.3樣品加標回收率的計算
取相同的兩份樣品，其中一份加入定量的待測成分標準物質(zhì)。兩份同時按相同的分析步驟分析，加標的一份所得的結(jié)果減去未加標一份所得的結(jié)果，其差值同加入標準物質(zhì)的理論值之比即為樣品加標回收率。加標回收率測定是實驗室用以自控的一種質(zhì)量控制技術(shù)。
加標回收率的公式為p=（C2×V2 - C1×V1）/(C0×V0)×100%。其中p為加標回收率，C2加標樣的濃度，C1為未加標樣的濃度，V2為加標后的體積，v1未加標樣的體積。C0為所加標準溶液的濃度，V0為所加標準溶液的體積。
4.4不同方法樣品所測濃度相對偏差的計算
不同方法樣品所測濃度相對偏差的簡化公式為d=（C2-C1）/(C2+C1)*100%。C1,C2為兩種不同方法所測的樣品濃度。
5.結(jié)果
5.1萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽
5.1.1亞硝酸鹽加標回收率
利用加標回收率公式p=（C2×V2-C1×V1）/(C0×V0)×100%進行計算，得到各個加標回收率值。結(jié)果如表1-1所示。
表1-1亞硝酸鹽加標回收率 form 1-1 spiked recoveries of nitrite
5.2鎘柱還原法測定硝酸鹽
5.2.1硝酸鹽加標回收率
利用加標回收率公式p=（C2×V2-C1×V1）/(C0×V0)×100%進行計算，得到各個加標回收率值，結(jié)果如表1-2所示。
表1-2硝酸鹽加標回收率 form 1-2 spiked recoveries of nitrate
5.3靛酚藍分光光度法測定氨氮
5.3.1氨氮加標回收率
利用加標回收率公式p=（C2×V2-C1×V1）/(C0×V0)×100%進行計算，得到各個加標回收率值，結(jié)果如表1-3所示。
表1-3氨氮加標回收率 form 1-3 spiked recoveries of ammonia
5.4流動注射自動光度法測定氨氮
流動注射自動光度法測定氨氮加標回收率結(jié)果如表1-4所示。
表1-4 氨氮加標回收率 form 1-4 spiked recoveries of ammonia
5.5流動注射自動光度法測定硝酸鹽
流動注射自動光度法測定的硝酸鹽加標回收率結(jié)果如表1-5所示。
表1-5 硝酸鹽加標回收率 form 1-5 spiked recoveries of nitrate
5.6流動注射自動光度法測定亞硝酸鹽
流動注射自動光度法測定的亞硝氮加標回收率結(jié)果如表1-6所示。
表1-6亞硝氮加標回收率 form 1-6 spiked recoveries of nitrite
6.1流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法的比較
6.1.1流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法原理的比較
流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法原理的比較如表2-1所示。
表2-1方法原理的比較 form 2-1 comparative of principle
6.1.2流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法比色波長的比較
流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法比色波長的比較如表2-2所示。
表2-2比色波長的比較 form 2-2 comparative of wavelength
6.1.3流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法加標回收率的比較
為了驗證各個實驗測定結(jié)果的準確性及對不同方法的準確性進行比較，進行了加標回收率實驗。
萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽的加標回收率如表1-1所示，分別為98.2%、104%、102%、97.4%、97.8%、97.8%，回收率范圍為97.7%—102%?；厥章手刀荚谠试S范圍之內(nèi)。從回收率可以看出實驗結(jié)果的準確度還是很高的。流動注射自動光度法中，亞硝酸鹽的回收率如表1-6所示，分別為93.8%、93.0%、93.8%、92.5%、93.6%，回收率范圍為92.5%—93.8%?；厥章手低瑯佣荚谠试S范圍之內(nèi)。通過比較可以看出，兩種方法測定的結(jié)果準確度都很高。
鎘柱還原法測定硝酸鹽的加標回收率如表1-2所示，分別為110%、108%、110%、95.3%、102%，回收率范圍為95.3%—110%?；厥章手刀荚谠试S范圍之內(nèi)。流動注射自動光度法測定硝酸鹽的回收率如表1-5所示，分別為104%、105%、110%、109%、110%，回收率范圍為104%—110%,均在允許范圍之內(nèi)。通過比較，可以看出兩種方法都有較高的準確度。
靛酚藍分光光度法測定氨氮的加標回收率如表1-3所示，分別為109%、110%、89.2%、88.4%、80.0%、110%，回收率范圍為80.0%—110%。流動注射自動光度法中氨氮的回收率如表1-4所示，為80.5%、84.7%、90.0%、97.0%、97.5%、104%，回收率范圍為80.5%—104%，在允許范圍之內(nèi)。通過比較可以看出兩種方法都有較高的準確度。
6.1.4流動注射自動光度法與傳統(tǒng)手工法方法測定結(jié)果的比較
鎘柱還原法與流動注射自動光度法測定硝酸鹽的結(jié)果以及相對偏差如表2-4所示。
表2-4硝酸鹽測定結(jié)果及相對偏差
form 2-4 measured results of nitrate and the relative deviation
表2-4中可以看出，鎘柱還原法所測的結(jié)果與流動注射自動光度法所測的結(jié)果基本相近，鎘柱還原法與流動注射自動光度法測定硝酸鹽的相對偏差為0.50%-6.92%，結(jié)果表明兩種方法沒有明顯差異。
靛酚藍分光光度法與流動注射自動光度法測定氨氮的結(jié)果以及相對偏差如表2-5所示。
表2-5氨氮的測定結(jié)果以及相對偏差
form 2-5 measured results of ammonia and the relative deviation
從表2-5可以看出，靛酚藍分光光度法所測的結(jié)果與流動注射自動光度法測定的結(jié)果基本相近，兩種方法測定結(jié)果的相對偏差為5.88%—10.7%。結(jié)果表明兩種方法沒有明顯差異。
萘乙二胺分光光度法與流動注射自動光度法測定亞硝酸鹽的結(jié)果以及相對偏差如表2-3所示。
從表2-3可以看出，兩種方法測定的亞硝酸鹽濃度相近，相對偏差為0—11.1%，兩種方法所測的結(jié)果沒有明顯差異。流動注射自動光度法在測定海水亞硝酸鹽時可靠性是很高的。
6.2與其他類似實驗的比較
吳金苗在《水環(huán)境中亞硝酸鹽氮、氨氮及鐵（Ⅲ）自動分析方法研究》的研究中，同樣進行了流動注射法與國標法的比較實驗，其得出的結(jié)果是亞硝酸鹽的相對偏差在5%以下。氨氮的相對偏差在8%以下。5個樣品中流動注射法所測的氨氮濃度4個高于國標法，一個低于國標法[9]。本次實驗的結(jié)果與其相似，流動注射法與國標法的比較,亞硝酸鹽的相對偏差在5%左右。氨氮的相對偏差在8%左右。
表2-3亞硝酸鹽測定結(jié)果及相對偏差
form 2-3 measured results of nitrite and the relative deviation
7.總結(jié)
本次實驗采用流動注射自動光度法與國家標準中的仲裁方法分別測定不同區(qū)域的海水樣品中的氨氮、硝氮、亞硝氮的濃度。通過方法原理、比色波長、樣品加標回收率、測定結(jié)果相對偏差對兩種方法進行比較研究。從方法原理和比色波長的來看，兩類方法不存在太大差別。從樣品測定結(jié)果的相對偏差來看，傳統(tǒng)手工方法與流動注射自動光度法的測定結(jié)果基本相近，不存在明顯的差異。說明流動注射自動光度法不但在測定淡水無機氮時是可靠的，在測定海水無機氮時準確度也是很高的。從加標回收率來看，傳統(tǒng)手工方法和流動注射自動光度法的加標回收率都在允許范圍之內(nèi)，表明傳統(tǒng)手工方法和流動注射自動光度法測定海水無機氮結(jié)果準確度都是較高的。
總的來說，流動注射自動光度法測定海水無機氮具有較高的可靠性。與傳統(tǒng)方法相比，其測定結(jié)果也沒有明顯的差異，此外流動注射自動光度法在測定大量樣品時具有很大的優(yōu)勢，不僅操作簡單而且測定速度快，能節(jié)省大量時間。流動注射自動光度法完全可以替代手工方法測定海水無機氮。
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[13] 中華人民共和國國家標準.海洋監(jiān)測規(guī)范第四部分:海水分析GB 17378.4-2007:109-110.
