膽固醇是食品中的重要組分之一，準(zhǔn)確地測定奶粉樣品中的膽固醇含量對指導(dǎo)嬰兒或中老年人的健康膳食具有重要意義。食品樣品中的膽固醇?xì)庀嗌V法測定通常采用GB9695.24-2008方法，但在實際操作中該法存在操作繁瑣、有機溶劑消耗大、樣品的測定結(jié)果重復(fù)性較差等缺點。本實驗通過校測不同脂肪含量對奶粉中膽固醇測定的影響，從而對奶粉樣品的膽固醇?xì)庀嗌V外標(biāo)法測定作了改進，完善了此類樣品的檢測過程，得到滿意的結(jié)果。
一、材料與方法
1.試劑與設(shè)備
乙醚(分析純)、石油醚(分析純)，氯化鈉溶液(100g/L)。KOH-乙醇溶液(1mol/L):稱量12gKOH(分析純)，加入200mL無水乙醇攪拌混勻充分溶解，冷卻后裝入廣口塑料瓶內(nèi)，然后放入冰箱以4℃儲存，最后取其上層澄清溶液使用。脂肪基底溶液(0.1g/mL):取市售豬油，準(zhǔn)確稱量10g，以氯仿充分溶解移入100mL容量瓶，再以氯仿定容至刻度。
設(shè)備包括具塞量筒、回流皂化器、恒溫水浴鍋、分析天平、HP6890 Plus氣相色譜儀等。
2.實驗方法
(1)奶粉樣品的脂肪提取
奶粉樣品中的脂肪提取采用哥特羅-羅紫法(參照GB5009.46-2003)，本實驗檢測了兩種奶粉樣品，即已充分混合均勻的低脂、全脂奶粉。首先測定樣品的脂肪比例，根據(jù)樣品的脂肪含量不同脫脂奶粉稱取2.0g，全脂奶粉稱取1.0g左右。全量提取后的石油醚-乙醚溶液取45mL，待溶劑旋轉(zhuǎn)揮發(fā)干燥稱重后分別顯示提取出脂肪量約0.1g(低脂奶粉)、0.4g(高脂奶粉)。需要檢測膽固醇的樣品提取液在旋轉(zhuǎn)瓶揮發(fā)完畢后無需轉(zhuǎn)移，直接進入下一步皂化程序。
(2)皂化
在每個皂化瓶中加入1mol/L的KOH-乙醇溶液皂化液5mL，混勻后，90℃恒溫回流皂化1h，取下稍混勻數(shù)次，將皂化液轉(zhuǎn)移至20mL比色管內(nèi)，加1mL100g/L的氯化鈉溶液于皂化瓶中充分溶解未完全轉(zhuǎn)移的皂化液體，再加4mL氯化鈉溶液于皂化瓶震蕩全量轉(zhuǎn)移至20mL比色管中，涼水冷卻。
(3)提取
在每個比色管中加入5mL石油醚，密閉管口劇烈震蕩5min，靜置分層30min后待檢。
(4)繪制膽固醇工作曲線
根據(jù)樣品提取出的脂肪量分別制作相應(yīng)的工作曲線，在工作曲線各點加入與樣品基體相當(dāng)?shù)闹净w，本實驗針對低脂、高脂奶粉樣品分別制作工作曲線1與工作曲線2(見圖1)。工作曲線1:取5只皂化瓶，各加入自行配制的脂肪基體溶液0.1mL，再分別加入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)吹干，則每點加入的脂肪為0.1g，仿照樣品皂化處理，該工作曲線適用于低脂奶粉樣品的檢測。工作曲線2各點加入脂肪基體溶液0.4mL，余同前，該曲線適用于高脂奶粉樣品檢測。
<CTSM>圖1不同奶粉膽固醇檢測工作曲線對比</CTSM>
(5)色譜條件
HP6890 Plus氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器。進樣口溫度為300℃，檢測器溫度為300℃。大口徑毛細(xì)柱OV-101，15m×0.53mm×1.0μm(在其他一些相關(guān)研究中用HP-1大口徑毛細(xì)柱，本方法采用極性常數(shù)相當(dāng)?shù)?01柱)。升溫程序:初始溫度為150℃，以30℃/min的速度升至260℃，保持4min。載氣流速為10mL/min，進樣量為1.0μL，分流進樣，分流比為1:1，樣品出峰時間為7.07min。
二、結(jié)果與討論
1.實驗條件優(yōu)化
對實驗中所需氯化鈉溶液與石油醚用量進行考察。分別比較了兩種不同濃度氯化鈉溶液(50g/L與100g/L)對萃取效率的影響，結(jié)果表明對同一個樣品其萃取效果是一致的。此外，分別比較了5mL、10mL、15mL不同體積的石油醚萃取效果，以10mL石油醚萃取無論是在萃取后體積的穩(wěn)定方面還是在保證樣品中膽固醇的定量檢出方面均表現(xiàn)較好，因此，本實驗選擇萃取時氯化鈉溶液濃度為100g/L、石油醚體積為10mL。
2.標(biāo)準(zhǔn)譜圖、準(zhǔn)確度、檢出限與線性范圍
膽固醇標(biāo)準(zhǔn)色譜峰如圖2所示，膽固醇峰形對稱，其保留時間與峰面積的重現(xiàn)性良好。采用程序升溫改善了膽固醇的峰形，節(jié)約了樣品檢測時間。
<CTSM>圖2膽固醇標(biāo)準(zhǔn)譜圖</CTSM>
由于膽固醇為高沸點物質(zhì)，在低濃度情況下其峰形變寬，不利于準(zhǔn)確地積分。為確定最低檢出濃度，逐級稀釋配制不同濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣表明，在當(dāng)前的實驗條件下，可以檢出的最低濃度為0.01mg/mL，按1μL進樣水平其最低檢測量為0.01g(3S/N)，如以取樣量2g計算，則樣品最低檢測含量為25mg/kg。在(0.02～1.0)mg/mL之間曲線線性良好，兩條工作曲線如圖1所示，由圖可見兩曲線的斜率完全不同。低脂奶粉的斜率高于高脂奶粉的斜率，由此可知若僅以一種曲線來定量不同的奶粉膽固醇含量必將引入明顯的測定誤差。
3.檢測結(jié)果及加標(biāo)回收實驗
對同一批次的低脂與高脂奶粉進行的樣品檢測結(jié)果如表1所示。
<CTSM>表1不同脂肪含量奶粉樣品膽固醇檢測一覽表</CTSM>
本實驗同時對高脂奶粉樣品開展了回收實驗，加標(biāo)量為0.0896mg膽固醇，實驗結(jié)果如表2所示。
<CTSM>表2高脂奶粉膽固醇加標(biāo)回收實驗結(jié)果一覽表</CTSM>
三、小結(jié)
為準(zhǔn)確地檢測奶粉中的膽固醇，先決條件是必須準(zhǔn)確地提取奶粉中的所有脂肪含量。有人以索氏抽提器來提取奶粉中的脂肪，然而實驗證明這種提取方法并不能完全將奶粉中的脂肪完全提取出來。這是因為奶粉中的脂肪有相當(dāng)一部分是結(jié)合在酪蛋白中的，需要以堿性條件將其游離出來。
一直以來，常規(guī)奶粉樣品的膽固醇含量測定一直采用分光光度法或氣相色譜測定方法GB9695.24-2008。但以這些方法檢測實際食品樣品時遇到的主要問題是，不同脂肪量與不同取樣量導(dǎo)致的檢測結(jié)果不平行。多次實驗表明，提取用石油醚液體的體積，或是氯化鈉溶液的濃度，對同一批樣品定量均沒有明顯的影響，但是皂化時脂肪的量對萃取效率產(chǎn)生了明顯作用，這可能是因為在石油醚萃取時脂肪皂化液的基體不同，對膽固醇在兩相間分配系數(shù)產(chǎn)生不同影響造成的。實驗表明，石油醚對脂肪較多的皂化液提取效率明顯降低，因此對樣品的精確定量產(chǎn)生了較大的影響。在實驗中，將不同脂肪含量的樣品分組是解決這個問題的較好辦法。將此類樣品分別歸組，并盡量控制好原始樣品的稱重，控制其脂肪提取物的重量在此范圍內(nèi)。實驗結(jié)果顯示，按此方法制作的工作曲線在不同檢測日檢測結(jié)果比較穩(wěn)定。
注：華南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)-國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購平臺
