淀粉酶包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，其中α-淀粉酶隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等糖類，同時(shí)使淀粉漿的黏度下降，因此又稱為液化酶；β-淀粉酶每次從淀粉的非還原端切下1分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。幾乎所有植物中都存在有淀粉酶，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子淀粉酶活力最強(qiáng)。淀粉酶在食品、制酒和制藥等工業(yè)中有廣泛應(yīng)用[1]。本文通過(guò)測(cè)定小麥種子不同萌發(fā)階段的淀粉酶活力，尋找α-淀粉酶和β-淀粉酶的最適宜提取時(shí)期，并進(jìn)一步研究不同化學(xué)環(huán)境對(duì)2種淀粉酶活力的影響，以提高淀粉酶在工業(yè)領(lǐng)域的利用效率。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料供試材料：小麥種子，品種為河北9411，由天津瑋達(dá)生物公司提供。供試儀器為恒溫培養(yǎng)箱、721E型分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、800型臺(tái)式低速離心機(jī)。試驗(yàn)水為蒸餾水。碘貯存液：于約400mL蒸餾水中溶解1.7835g碘酸鉀、22.5g碘化鉀，緩緩加人4.5mL濃鹽酸，邊加邊攪拌，再用蒸餾水稀釋至500mL，充分混勻，貯棕色瓶于冰箱內(nèi)保存[2]。碘應(yīng)用液：貯存液50倍稀釋，置冰箱內(nèi)可用1個(gè)月。1％淀粉：稱取10g可溶性淀粉，加入約50mL蒸餾水使之成糊狀后倒入500mL沸騰的蒸餾水中，再用蒸餾水洗凈小燒杯內(nèi)淀粉，至少2次，冷至室溫后用蒸餾水稀釋至1L，于冰箱內(nèi)保存。緩沖液：0.1moL/LpH值為5.6的檸檬酸緩沖液（每20mL緩沖液中含0.1moL/L檸檬酸5.5mL和0.1moL/L檸檬酸鈉14.5mL）。0.1moL/LH2SO4，硫酸鈉、硫酸銅、氯化鈣、氯化鋁各0.5moL/L。以上試劑不加說(shuō)明者，均為分析純。
1.2樣品制備方法
1.2.1小麥種子的培養(yǎng)。供試小麥種子經(jīng)蒸餾水漂洗浮選后，用3倍體積的蒸餾水浸泡，25℃恒溫培養(yǎng)箱放置24h后，轉(zhuǎn)移至鋪有紗布的培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天按時(shí)加水。
1.2.2淀粉酶液的制備。稱取4g小麥種子，置于研缽中，加入少量石英砂和10mL蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6mL蒸餾水分2次將殘?jiān)慈腚x心管。提取液在室溫下放置提取15~20min，每隔數(shù)分鐘攪動(dòng)1次，使其充分提取。然后在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，將上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。淀粉酶原液經(jīng)過(guò)70℃水浴15min鈍化β-淀粉酶[3]后，用于α-淀粉酶活力測(cè)定。吸取上述淀粉酶原液5mL，放入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測(cè)定。
1.3淀粉酶活力測(cè)定方法
在Yoo改良法[4]基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取1mL相應(yīng)酶液（對(duì)照管準(zhǔn)確吸取1mL蒸餾水），置于比色管中，加入0.1moL/LpH值為5.6的檸檬酸緩沖液4mL搖勻，于40℃水浴預(yù)熱5min，準(zhǔn)確加入1％可溶性淀粉溶液(40℃水浴預(yù)熱)1mL，立即計(jì)時(shí)，搖勻，于40℃水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)5min后，加0.1moL/L的H2SO45mL終止反應(yīng)。取0.5mL反應(yīng)液加入2mL碘應(yīng)用液顯色，再加入3.5mL蒸餾水搖勻，以2mL碘應(yīng)用液加入4mL蒸餾水為空白，在1cm比色皿、620nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。1個(gè)酶活力單位（U）定義為1g鮮重種子中的淀粉酶40℃5min內(nèi)水解10mg淀粉的酶量。淀粉酶活力按以下公式計(jì)算[5-6]：
淀粉酶活力=[（AB-AU）/AB]×酶液總體積/4
α-淀粉酶活力=25×（AB-AU）/AB
總淀粉酶活力=500×（AB-AU）/AB
β-淀粉酶活力＝總淀粉酶活力-α-淀粉酶活力
上式中：AB為對(duì)照管吸光度，AU為測(cè)定管吸光度。
2結(jié)果與分析
2.1萌發(fā)時(shí)間對(duì)2種淀粉酶活力的影響。由表1可知，2種淀粉酶在萌發(fā)過(guò)程中活力的變化趨勢(shì)決定了α-淀粉酶活力占總酶活力的比例在萌發(fā)前期迅速升高，在萌發(fā)3d達(dá)到最高值后緩慢下降，而β-淀粉酶活力占總酶活力的比例在萌發(fā)前期先緩慢下降，在萌發(fā)3d達(dá)到最低值后再緩慢上升。在總淀粉酶活力中β-淀粉酶活力占據(jù)了絕大部分，在萌發(fā)過(guò)程中α-淀粉酶活力占總酶活力的比例最高時(shí)只有6.17%。為盡可能多的獲得α-淀粉酶，應(yīng)選擇萌發(fā)3d的小麥種子進(jìn)行提取。其變化趨勢(shì)如圖1所示。由圖1可知，小麥種子在浸泡之前的休眠狀態(tài)中2種淀粉酶均具有一定的活力，其中α-淀粉酶活力比較微弱，而β-淀粉酶活力較為明顯。浸泡24h后，β-淀粉酶活力表現(xiàn)出了明顯的下降。從萌發(fā)后1d開始2種淀粉酶活力均穩(wěn)步增長(zhǎng)，其中α-淀粉酶活力增長(zhǎng)迅速，并在萌發(fā)的3d活力達(dá)到最大，隨后α-淀粉酶活力開始緩慢下降。與α-淀粉酶相比，β-淀粉酶活力增長(zhǎng)比較平緩且在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)始終保持增長(zhǎng)，但從萌發(fā)5d開始增速放緩。
2.2化學(xué)環(huán)境對(duì)2種淀粉酶活力的影響。取萌發(fā)3d的小麥種子按1.2.2方法制備酶液。選擇硫酸鈉、硫酸銅、氯化鈣和氯化鋁等4種常見(jiàn)的鹽類，分別配制成0.5moL/L溶液。在使用1.3方法測(cè)定酶活力的過(guò)程中，于40℃水浴預(yù)熱前移取不同體積的不同鹽類加入到反應(yīng)體系中搖勻，加鹽量如表2所示，不足2mL部分用蒸餾水補(bǔ)齊，對(duì)照管相應(yīng)地加入2mL蒸餾水。計(jì)算α-淀粉酶活力和β-淀粉酶活力后，以不加鹽時(shí)的酶活力為100%換算成相對(duì)酶活力，結(jié)果見(jiàn)表2。
由表2可知，在測(cè)定范圍內(nèi)氯化鈣對(duì)β-淀粉酶活力有一定促進(jìn)作用，加鹽量為0.3mL時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，酶活力可達(dá)無(wú)鹽時(shí)的128.93%，該加鹽量下氯化鈣對(duì)α-淀粉酶活力也表現(xiàn)為促進(jìn)，酶活力可達(dá)無(wú)鹽時(shí)的102.90%。但隨著加鹽量增加，氯化鈣對(duì)α-淀粉酶活力表現(xiàn)出緩慢增強(qiáng)的抑制作用。硫酸鈉對(duì)2種淀粉酶活力的影響都不大，在相同加鹽量下，α-淀粉酶受到的影響略大于β-淀粉酶。硫酸銅和氯化
鋁對(duì)2種淀粉酶活力都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用，在低加鹽量下抑制作用就十分明顯，其中加硫酸銅量為0.3mL時(shí)的β-淀粉酶活力只有無(wú)鹽時(shí)的67.67%，且隨著加鹽量提高，抑制作用不斷增強(qiáng)。硫酸銅對(duì)2種淀粉酶的抑制作用要強(qiáng)于氯化鋁，在一定加鹽量范圍內(nèi)β-淀粉酶活力受到硫酸銅和氯化鋁的抑制作用要強(qiáng)于α-淀粉酶。
3結(jié)論與討論
試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥種子在浸泡之前的休眠狀態(tài)中2種淀粉酶均具有一定活力，其中α-淀粉酶活力比較微弱而β-淀粉酶活力較為明顯。萌發(fā)后2種淀粉酶活力均穩(wěn)步增長(zhǎng)，α-淀粉酶活力3d達(dá)到峰值并開始下降，其占總酶活力的比例也有相同趨勢(shì)，最高時(shí)達(dá)6.17％。為盡可能多的獲得α-淀粉酶，應(yīng)選擇萌發(fā)3d的小麥種子進(jìn)行提取[6-12]。β-淀粉酶活力始終保持增長(zhǎng)。
化學(xué)環(huán)境變化方面，在測(cè)定范圍內(nèi)氯化鈣對(duì)β-淀粉酶活力有一定的促進(jìn)作用；硫酸鈉對(duì)2種淀粉酶活力的影響都不大，在相同加鹽量下α-淀粉酶受到的影響略大于β-淀粉酶；硫酸銅和氯化鋁對(duì)2種淀粉酶活力都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用，在低加鹽量下抑制作用十分明顯，在一定加鹽量范圍內(nèi)β-淀粉酶活力受到硫酸銅和氯化鋁的抑制作用要強(qiáng)于α-淀粉酶[13-14]。
注：華南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)-國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購(gòu)平臺(tái)
