一、前言
食用合成色素已列入GB2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。目前，食品中合成色素的檢測方法(GB/T5009.35-2003)是:先將樣品中合成色素用聚酰胺粉吸附，然后在堿性條件下解吸附，再用液相色譜法進(jìn)行分離后與標(biāo)準(zhǔn)品比較定性、定量。本方法利用SPE小柱選擇分離性強(qiáng)的特點(diǎn)，通過小柱吸附色素，然后去掉干擾物，解析定容后采用液相色譜定性、定量。本法較之于國標(biāo)法，前處理簡單快速，回收率高。
二、試劑
1.甲醇:色譜純
2.氨水:分析純
3.氨化甲醇溶液(2%):準(zhǔn)確量取2mL氨水和98mL甲醇混勻備用。
4.乙酸銨(0.02mol/L):稱取1.54g乙酸銨，加水溶解，定容至1000mL，經(jīng)0.45μm過濾器過濾。
5.石油醚:沸程為60℃～90℃。
6.固相萃取柱:StrataX-AW60mg/3mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化并保持濕潤。
7.合成色素標(biāo)準(zhǔn)溶液
(1)胭脂紅:1000μg/mL；莧菜紅:1000μg/mL；檸檬黃:1000μg/mL；日落黃:1000μg/mL；亮藍(lán):1000μg/mL，以上均由中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所研制。
(2)誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為固體粉末，稱量0.1000g，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。此濃度為1000μg/mL。
(3)標(biāo)準(zhǔn)儲備液:臨用前吸取上述色素溶液各10mL至100mL容量瓶,再用水定容，此為使用液，各色素濃度均為100μg/mL。
三、儀器
1.高效液相色譜儀:Agilent1100(配有紫外檢測器)。
2.電子天平:感量為0.1mg。
3.高速離心機(jī):4000r/min。
4.勻漿機(jī)。
5.超聲波清洗器。
6.氮吹儀。
7.固相萃取裝置。
8.漩渦混合器。
四、操作方法
1.樣品處理
(1)飲料類樣品:吸取10.0mL樣品于25mL比色管中，含二氧化碳的樣品需超聲振蕩驅(qū)除二氧化碳。
(2)配制酒類樣品:吸取10.0mL樣品于25mL比色管中，水浴加熱驅(qū)除乙醇。
(3)硬糖、淀粉軟糖、蜜餞類樣品:稱取5.0g粉碎的樣品于25mL比色管中，加10mL水，60℃水浴溫?zé)崛芙?，過濾備用。
(4)其他固體樣品
①香腸、午餐肉等肉制品:稱取5.0g粉碎均勻的樣品于25mL比色管中(如脂肪含量較高，需加10mL石油醚萃取除去脂肪)，加10mL水，勻漿、超聲提取10min，離心后過濾，收集濾液。
②糕點(diǎn)類及一般固體樣品:稱取5.0g粉碎均勻的樣品于25mL比色管中(如脂肪含量較高，需加10mL石油醚萃取除去脂肪)，加10mL水，漩渦震蕩2min，超聲提取10min，離心后過濾，收集濾液。
2.凈化
將上述濾液，置于80℃水浴中濃縮至約2mL，然后將處理后所得的溶液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，依次用3mL甲醇、3mL水洗滌，棄去全部流出液，抽至近干時(shí)，用5mL氨化甲醇溶液洗脫。注意:整個(gè)過程控制流速不超過1mL/min。將洗脫溶液置于氮吹儀上，用50℃氮?dú)獯蹈?，再?mL水溶解，漩渦混合1min，經(jīng)0.45μm過濾器過濾后備用。
3.高效液相色譜測定
(1)色譜條件
①色譜柱:ZORBAXSB-C185μm4.6×250mm
②流動(dòng)相:甲醇-乙酸銨溶液(0.02mol/L)。
③梯度洗脫:梯度洗脫條件如表1所示。
<CTSM>表1梯度洗脫條件</CTSM>
④進(jìn)樣量:20μL。
⑤柱溫:23℃，波長254nm。
(2)測定
6種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖如圖1所示。
<CTSM>圖16種著色劑標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖</CTSM>
(3)根據(jù)保留時(shí)間定性，外表峰面積定量，計(jì)算:
X=(C×V×1000)/(m×1000)
式中:X——樣品中色素的含量，mg/kg；C——測定用樣液中色素的含量，μg/mL；m——樣品質(zhì)量，g；V——樣品定容后總體積，mL。
五、樣品的線性范圍、檢出限、回收率以及精密度
將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成(單位:μg/mL)0.100、0.200、0.400、1.00、3.00、5.00的標(biāo)準(zhǔn)系列，經(jīng)0.45μm過濾器過濾后，在液相上進(jìn)行定量分析得出回歸方程和線性范圍并計(jì)算出檢出限，如表2所示。
<CTSM>表2回歸方程、線性范圍及檢出限</CTSM>
選擇果味飲料、蜜餞、火腿腸、烤蛋糕4種不同樣品，添加5.0mg/kg標(biāo)準(zhǔn)樣品，扣除空白后計(jì)算出回收率。同時(shí)選取蜜餞，連續(xù)測定5次，計(jì)算出精密度，具體結(jié)果如表3、表4所示。
<CTSM>表3不同產(chǎn)品添加相應(yīng)著色劑的回收率</CTSM>
<CTSM>表4同一樣品添加后連續(xù)測定5次的精密度</CTSM>
六、結(jié)果討論
1.本方法在前處理方面與國標(biāo)檢驗(yàn)方法比較:因?yàn)椴捎肧PE小柱對著色劑進(jìn)行了有效的吸附分離，所以前處理所需的時(shí)間和步驟均明顯優(yōu)于國標(biāo)，節(jié)省了大量的人力和物力。
2.本方法回收率方面與國標(biāo)檢驗(yàn)方法比較:本方法著色劑回收率基本控制在91%～98%之間，回收率較高，精密度均小于5%。而國標(biāo)聚酰胺粉吸附法回收率基本在80%～90%之間，所以本方法在回收率方面優(yōu)于國標(biāo)法。
3.目前，國標(biāo)(GB/T5009.141-2003)誘惑紅檢測采用的紙色譜法，前處理為聚酰胺粉吸附，檢出限為25mg/kg，本方法在前處理和檢出限方面都明顯優(yōu)于國標(biāo)。
原子熒光標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制是一個(gè)稀釋的過程，即將購買的高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按要求、比例稀釋到所需濃度，使之成為一個(gè)濃度序列，檢定測得的原子熒光值呈線性關(guān)系。所以，溶液配制得好壞將直接影響到檢定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因?yàn)樯椤R的測定條件基本相同，所以此兩種元素可以同時(shí)測定。因此，JJG939-2009《原子熒光光度計(jì)》檢定規(guī)程要求配制的是兩種元素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。JJG939-2009中所提供的檢定用試劑和溶液配制方法比較簡單，下面就原子熒光光度計(jì)檢定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、保存及注意事項(xiàng)進(jìn)行總結(jié)討論。
一、原子熒光光度計(jì)檢定所需試劑及其性質(zhì)
1.鹽酸:優(yōu)級純(GR)
濃鹽酸為無色或微黃色易揮發(fā)液體，有刺激性氣味。能與水混溶，溶于堿液。對其的操作應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
2.硼氫化鉀(硼氫化納)
純度不低于95%。白色至灰白色細(xì)結(jié)晶粉末或塊狀，吸濕性強(qiáng)，因此需與干燥劑一起存放。能溶于水、液氨，不溶于乙醚、苯、烴類，性質(zhì)穩(wěn)定，還原性強(qiáng)，其溶液在此主要作為還原劑使用。因?yàn)榕饸浠浫芤阂姽庖追纸?，其溶液需用棕色瓶避光保存?/span>
3.氫氧化鉀(氫氧化鈉)
分析純(AR)是用來保護(hù)硼氫化鉀的。常溫下是一種白色晶體，具有吸水性、強(qiáng)腐蝕性；易溶于水，同時(shí)放出大量熱。
4.硫脲:分析純(AR)
白色光亮苦味晶體，能溶于冷水、乙醇，微溶于乙醚，20℃時(shí)在水中的溶解度為137g/L。有毒性，接觸皮膚會吸收，因此配制溶液時(shí)應(yīng)避免與皮膚接觸。
5.二次去離子水
指去離子水經(jīng)過亞沸蒸餾得到的水，一般用在物化或分析試驗(yàn)中。其中，用離子交換法制備的水被稱為去離子水，去離子水不是沒有離子的水，而是經(jīng)過離子交換得到的沒有干擾離子、pH值為中性的水(干擾離子一般指鈣、鎂、碳酸根、硫酸根等，但是去離子水一般含有的有機(jī)物質(zhì)是不能去除的)。去離子水不同于蒸餾水，蒸餾法只能除去水中非揮發(fā)性的物質(zhì)，并不能除去溶解在水中的氣體，蒸餾水純度一般不如去離子水，去離子水比蒸餾水電導(dǎo)率更小。通常情況下，普通定量分析蒸餾水就可以，儀器用水一般根據(jù)結(jié)果量級選擇用水，最低標(biāo)準(zhǔn)是去離子水，這里因?yàn)榻Y(jié)果量級比較高，因此使用的是二次去離子水。
6.標(biāo)準(zhǔn)溶液
砷標(biāo)準(zhǔn)原液(GBW08611，1000μg/mL，U=1μg/mL，k=2，中國計(jì)量科學(xué)研究院)、銻(GBW(E)080545，100μg/mL，U=1%，k=2)。
二、原子熒光光度計(jì)檢定用試劑配制所需設(shè)備
1.天平:最大秤量為200g或500g，分度值不大于0.1g。
2.玻璃量具(A級):100mL、200mL、1000mL容量瓶數(shù)個(gè)；100mL、500mL燒杯數(shù)個(gè)；1mL、5mL、10mL、20mL移液管或吸量管數(shù)個(gè)；玻璃棒。
3.其他實(shí)驗(yàn)用器具。
三、原子熒光光度計(jì)檢定用試劑配制、保存及注意事項(xiàng)
1.原子熒光光度計(jì)檢定用試劑的作用原理
JJG939-2009規(guī)定要配制的是砷、銻混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定砷和銻的關(guān)鍵是將As(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)還原為氫化物。As(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)與硼氫化鉀反應(yīng)的時(shí)間較長，As(Ⅲ)、Sb(Ⅲ)更容易形成氫化物。前處理應(yīng)將五價(jià)砷、銻先還原為三價(jià)，因此需要加入硫脲和抗壞血酸進(jìn)行預(yù)還原。JJG939-2009規(guī)定，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)需加入100g/L的硫脲水溶液，未提到抗壞血酸，是因?yàn)榭箟难岬淖饔檬鞘谷芤焊臃€(wěn)定并促進(jìn)還原，硫脲的作用是還原和對Cu2+、Co3+、Ni2+等離子起掩蔽作用，硫脲和抗壞血酸在一起還原效果更好。按照J(rèn)JG939-2009的要求，配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，則抗壞血酸的添加與否基本無影響。
進(jìn)行分析時(shí)，在酸性環(huán)境條件下同時(shí)加入硼氫化鉀溶液，發(fā)生以下反應(yīng):
NaBH4+3H2O+HCl→H3BO3+NaCl+8H→EHn+H2 (過量)
(2+n)H+Em+→EHn+H2
E為可形成氫化物元素(砷、銻)，m可以等于或不等于n。
形成的氫化物被原子化后，受光源光能所激發(fā)發(fā)生躍遷到較高能級，并在回到較低能級的同時(shí)輻射出原子熒光。
需要注意的是，硼氫化鉀是強(qiáng)還原劑，在中性和酸性的情況下易分解，與水或空氣中的氧氣和二氧化碳反應(yīng)，見光易分解。在溶液中加入氫氧化鉀可使其較穩(wěn)定地存在，保持低溫可減緩它的分解。同時(shí)，氫氧化鉀容易與玻璃中的硅發(fā)生反應(yīng)生成硅酸鈉，因此配好的溶液要用塑料瓶子進(jìn)行保存，以保持溶液的有效濃度。如現(xiàn)用現(xiàn)配，在玻璃器皿中影響不大。
2.原子熒光光度計(jì)檢定用試劑的配制
(1)100g/L的硫脲溶液的配制
以配制100mL的溶液為例。在分析天平上稱量10g硫脲(白色晶狀固體，放在小燒杯中用差重法稱量)，用少量二次去離子水溶解，玻璃棒輕輕攪動(dòng)，如溶解不完全可適當(dāng)水浴加熱，但不可溫度過高。用玻璃棒將溶解的硫脲溶液移入100mL的容量瓶中定容。硫脲溶液配制中，可加入抗壞血酸，亦可不加。
(2)100ng/mL的砷、銻標(biāo)準(zhǔn)儲存液的配制
逐級稀釋法，可以降低誤差，提高準(zhǔn)確性。所以在稀釋砷、銻標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，分兩步稀釋，以得到標(biāo)準(zhǔn)儲存液。用移液管或吸量管分別吸取砷標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL、銻標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL溶于100mL的容量瓶中，用二次去離子水定容，配制成10μg/mL的砷、銻標(biāo)準(zhǔn)中間液。再吸取1mL配制好的10μg/mL的砷、銻標(biāo)準(zhǔn)中間液于100mL容量瓶中，用二次去離子水定容。
(3)檢定用砷、銻標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的配制
用移液管或吸量管分別吸取100ng/mL砷、銻標(biāo)準(zhǔn)儲存液0mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL于100mL容量瓶中，分別加入100g/L的硫脲溶液20mL、濃鹽酸10mL，用二次去離子水稀釋至刻度。
(4)5%鹽酸溶液的配制
用量筒量取50mL的濃鹽酸，加入約200mL二次去離子水稀釋，然后移入1000mL的容量瓶中，用二次去離子水定容。
(5)硼氫化鉀溶液的配制
硼氫化鉀的濃度由被測元素濃度確定，載液酸濃度由硼氫化鉀的濃度確定，最終廢液呈酸性。日常檢定中，配制1.5%的硼氫化鉀溶液基本滿足檢定要求。具體配制方法是:在電子天平上稱取15g硼氫化鉀溶于預(yù)先加入5g氫氧化鉀的200mL二次去離子水中，攪拌至溶解，用玻璃棒引流轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，再用二次去離子水稀釋至刻度。
3.溶液配制中的注意事項(xiàng)
(1)對溶液配制時(shí)所使用的玻璃量具根據(jù)分析方法的不同進(jìn)行清洗。測定微量元素用的玻璃器皿，首先用毛刷蘸水刷洗，用水沖去可溶性物質(zhì)及刷去表面黏附的灰塵，接著將滴管、吸量管、小試管等浸于10%硝酸溶液中8h以上，然后用純水沖凈。洗凈的玻璃器皿倒置時(shí)，水流出后器皿壁應(yīng)不掛水珠。至此再用少量純水刷洗玻璃器皿3次，洗去自來水帶來的雜質(zhì)，自然瀝干。
(2)要注意配制的溶液的單位是質(zhì)量濃度還是體積濃度。
(3)固體試劑在燒杯中溶解后，用玻璃棒引流移入容量瓶，用二次去離子水少量多次清洗燒杯和玻璃棒，將清洗用水也倒入容量瓶，燒杯和容量瓶至少要清洗3～4次。
(4)定容時(shí)，先加二次去離子水稀釋至約3/4體積，再將容量瓶平搖幾次(切勿倒轉(zhuǎn)搖動(dòng))，作初步混勻。接著將二次去離子水加至接近刻度處，再一點(diǎn)點(diǎn)加入，使溶液的凹面與容量瓶刻線相切。然后用玻璃塞塞好，來回顛倒容量瓶數(shù)次使溶液充分混合均勻。
(5)使用移液管或吸量管量取試劑時(shí)，要先用欲取溶液淋洗2～3次后方可操作。
(6)吸取溶液時(shí)，移液管或吸量管的下口插入欲取的溶液中不能太淺或太深，太淺會產(chǎn)生吸空，把溶液吸到洗耳球內(nèi)弄臟溶液，太深又會使管外黏附過多溶液。
(7)為減少測量誤差，吸量管每次都應(yīng)將最上面的刻度作為起始點(diǎn)，往下放出所需體積，而不是放出多少體積就吸取多少體積。除吹出式吸量管外，殘留在吸量管末端的少量溶液，不可用外力強(qiáng)行使其流出。
(8)容量瓶使用前要進(jìn)行試漏，即在瓶內(nèi)裝入自來水到標(biāo)線附近，蓋上塞，用手按住塞，倒立容量瓶，觀察瓶口是否有水滲出，如果不漏，把瓶直立后，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶塞約180°后再倒立試一次。
(9)不要用容量瓶長期存放配好的溶液，配好的溶液如果需要長期存放，應(yīng)該轉(zhuǎn)移到干凈的磨口試劑瓶中。
(10)容量瓶長期不用時(shí)應(yīng)該洗凈，把塞子用紙墊上，以防時(shí)間長后，塞子打不開。
(11)還原劑濃度由試樣來定，載流液濃度由還原劑濃度來定，最后廢液呈酸性。如果不是酸性，硼氫化鉀會在管道壓力最低處沉淀，而后堵塞。
(12)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不能放置食物，以免交叉感染。
(13)如對自己所配硼氫化鉀溶液和載流液濃度存懷疑態(tài)度，可用pH試紙測試一下，如廢液呈酸性，則滿足實(shí)驗(yàn)要求；如廢液呈堿性，則硼氫化鉀溶液濃度過高。
(14)標(biāo)準(zhǔn)儲存液也可用5%鹽酸來制備，溶液性質(zhì)會更加穩(wěn)定，可保存較長時(shí)間。
4.原子熒光用溶液的保存
除標(biāo)準(zhǔn)儲存液在0～5℃條件下可保存6個(gè)月外，其他溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
注：華南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)-國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購平臺
