（The Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhuhai 519015, China）
Abstract: Nine exogenous DNA fragement were selected as target genes, their primers and probes were designed and synthesized, then the probes were immobilized in the Thin-Film Biosensor Chips. PCR was used to amplify the target sequence in food sample DNA, then the Biochip were hybridized with PCR product, at last the chip displayed the hybridization result. The method can detect 5 kinds of common modified plant, and the method is efficient, accurate, simple, high-throughput, practical, sensitive (0.1％), and get rid of the dependence of fluorescence scanner, with good application value..
Key words: Biochip; Genetically-modified; Food; Detection
隨著基因工程技術(shù)的日趨成熟及在農(nóng)產(chǎn)品上的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因食品對人和動物的健康及對生態(tài)環(huán)境的影響，已成為世界各國關(guān)注的焦點。據(jù)統(tǒng)計，2011年轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為1.6億公頃，比1996年增長94倍[1]，據(jù)估計，用轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)加工的食品全世界有近萬種[2]?；蚬こ陶莆盏牟淮_定性及不可預(yù)測性,使得轉(zhuǎn)基因食品安全問題成為目前人類在發(fā)展過程中必須面對的一個棘手的環(huán)境問題。[3]各國政府先后出臺了相應(yīng)的法律和管理辦法，對轉(zhuǎn)基因食品實行強制標(biāo)識或自愿標(biāo)識。我國于2002年7月開始實施《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理條例》，對轉(zhuǎn)基因食品產(chǎn)品進行標(biāo)識管理。目前國際上常用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法主要有酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）、PCR檢測、熒光定量PCR檢測等技術(shù)[2]，這些方法在對含有多種轉(zhuǎn)基因成分的樣品進行檢測時，容易漏檢，通量低[4]。
基因芯片技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高通量、平行化等優(yōu)點，是近年來迅速發(fā)展的一項高新生物技術(shù)[5-6]，普通基因芯片技術(shù)因為操作復(fù)雜，且需要專業(yè)的掃描儀器分析結(jié)果，限制了它在常規(guī)實驗室的應(yīng)用［7-11］。而本研究所用的可視芯片與傳統(tǒng)芯片相比，它通過肉眼就可以觀察到芯片雜交的信號，更有利于在基層實驗室推廣使用，可以廣泛地在只有PCR儀之類的基本分子生物學(xué)設(shè)備的個體實驗室或研究站投入使用［11］。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、方便、高通量的多基因芯片檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度和重現(xiàn)性進行測試。
1 材料和方法
1.1 儀器
梯度PCR儀Mastercycler pro S，德國eppendorf公司；7500Fast實時熒光定量PCR儀，美國ABI 公司；高速冷凍離心機3K18型，德國Sigma公司；超純水處理器milli-Q plus，法國密理博公司；高速離心機5430，德國eppendorf公司；電泳儀Power Pac300，美國Bio-rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)Aphaimager HP，美國Alpha公司；紫外交聯(lián)儀SCIENTZ 03-Ⅱ，新芝生物科技股份有限公司；芯片點樣儀Fast Spot，芯片雜交儀DR.Mini Oven，臺灣晶宇生物技術(shù)有限公司。
1.2 材料和試劑
轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號，轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻，轉(zhuǎn)基因玉米MON810，耐除草劑大豆MON89788，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(RRS1/GTS 40-3-2)，轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號，本實驗室檢測留樣。
DL2000 Ladder Marker 寶生物工程（大連）有限公司；Ex Taq(DR001A) 寶生物工程（大連）有限公司；Premix Ex Taq 2× (Perfect for Real Time) 寶生物工程（大連）有限公司；GoldViewTM 核酸染料 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；DR.Chip DIYTM Kit 購自臺灣晶宇生物技術(shù)有限公司。
1.3 引物與探針
本研究利用Primer Premier 5.0設(shè)計每段待測靶基因的備選探針，并注意使各探針的雜交動力學(xué)性質(zhì)相近。長度在20~40bp間。根據(jù)芯片的反應(yīng)原理，下游引物5’端以生物素標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記一段polyT。引物和探針由上海英駿生物公司合成。引物和探針序列見表1。
表1引物探針匯總表
Tab. 1 primers and probes summary table
1.4 芯片的制備
篩選出的靶基因點制成重復(fù)探針檢測點。以生物素標(biāo)記的PolyT作為芯片質(zhì)控點，以特異性序列探針作為陰性對照點，以點樣液作為空白對照點。設(shè)計出芯片的矩陣。見表2。
表2 芯片陣列設(shè)計示意表
Tab. 2 Schematic chart of the oligonuclecide microarrays
將合成的探針稀釋至30 pmol/μL，加入等體積的2×點樣緩沖液，按照預(yù)先設(shè)計好的列陣加入探針溶液盤中，每孔加入約15 μL。按操作說明使用DR.Fast Spot點樣儀點制芯片，點樣完畢后目測點樣區(qū)，檢測是否漏點，形狀是否規(guī)則。點制好的芯片室溫靜置5~10 min，在紫外交聯(lián)儀中254nm交聯(lián)700 s，加500uL超純水沖洗5 min兩次。加100 μL 95%乙醇20s后，放入50℃干燥箱中干燥10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
1.5 樣品DNA的提取
轉(zhuǎn)基因玉米MON810，轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號，轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(RRS1/GTS 40-3-2)，耐除草劑大豆MON89788，轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻及其他的轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻和非轉(zhuǎn)基因食品的DNA均采用CTAB法提取純化樣品DNA。
1.6 樣品DNA的PCR擴增
將待測樣品模板DNA、引物及反應(yīng)試劑按表3所示體積加入到PCR反應(yīng)管中。PCR反應(yīng)條件見表4。
反應(yīng)結(jié)束后，取5μL擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠（含0.05μL/ml的GoldViewTM）電泳檢測，電泳條件為120V，40min，用DL2000作為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量，紫外燈下檢測電泳結(jié)果并拍照分析。
表3 PCR反應(yīng)體系
Tab. 3 Reaction system of PCR experimen
表4 PCR反應(yīng)條件
Tab. 4 Reaction condition of PCR experimen
1.7 芯片的雜交和結(jié)果判讀
雜交：吸取1～25μL PCR擴增產(chǎn)物和200μL DR.HybTMBuffer混合于離心管中，100℃變性5 min，迅速冰浴5 min。把所有的雜交混合液轉(zhuǎn)移到芯片凹槽中，避免產(chǎn)生氣泡。置于45℃雜交箱中雜交45 min。
清洗：去除雜交液。加250 μL Wash Buffer到芯片凹槽中，去除洗液，重復(fù)兩次。
封閉：加封閉液（0.2 μL Strep-AP與200 μL Blocking Reagent混合液）到芯片凹槽中，室溫（25~35℃）反應(yīng)30 min。去除封閉液，加250 μL Wash Buffer到雜交室，去除洗液，重復(fù)兩次。將芯片在吸水紙上拍打，以吸出殘留的洗液。
顯色：加顯色液(4 μL NBT/BCIP與196 μL Detection Buffer混合液)到芯片凹槽中，避光室溫反應(yīng)5~10 min。去除顯色液，用超純水沖洗芯片，并讀取結(jié)果。
1.8 特異性試驗
按照1.7所述雜交過程以靶基因為單位，分別用不同的陽性對照核酸對靶基因進行擴增后與芯片進行雜交。確認(rèn)檢測特異性。
1.10 靈敏度試驗
利用本研究建立的可視芯片對0.01%，0.1%和0.5%陽性轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，確認(rèn)其檢測限。
1.11 重復(fù)性及穩(wěn)定性實驗
隨即抽取不同點樣批次和同一點樣批次的不同芯片各3張，在相同的條件下對轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，驗證芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
2 結(jié)果與分析
2.1 PCR擴增結(jié)果
17種靶基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，擴增效果如圖1所示。
圖1 17種靶基因PCR擴增
Fig.1 Amplify the 17 target sequence by PCR
M：DL2000 Ladder Marker；1：GOS；2：89788；3：CaMV35S；4：PAT；5：NOS；6：FMV35S；7：GOX；8：Lectin；9：ZEIN；10：tRNALeu；11：MON810；12：KF6；13：NPTII；14：Bar；15：Bt63；16：Cry；17：KMD
2.2 芯片檢測的特異性
通過獲得最佳雜交溫度和雜交時間后，17個靶基因經(jīng)PCR擴增后分別與檢測芯片上的探針進行雜交?；蛐酒s交結(jié)果結(jié)果如圖2所示，各種靶基因PCR產(chǎn)物均與芯片上的探針特異性結(jié)合，無交叉反應(yīng)。同時該芯片上點制的空白對照、陰性對照和質(zhì)控探針結(jié)果正常，形成了很好的監(jiān)控體系。上述的結(jié)果可以說明本方法具有很好的特異性，可以對轉(zhuǎn)基因植物進行準(zhǔn)確檢測。
PAT
圖2 芯片特異性雜交
Fig.2 Microarray hybridization result of specific experiment
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2.3靈敏度實驗
采用本研究建立的方法對不同含量的轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測。實驗結(jié)果表明，基因芯片雜交檢測靈敏度為0.1%。
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圖3芯片檢測靈敏度雜交圖
Fig.3 Microarray hybridization result of sensitivity experiment
2.4重復(fù)性及穩(wěn)定性實驗
以BT63基因為例，對3張不同點樣批次和同一點樣批次的3張不同芯片，在相同的條件下進行雜交試驗，分析基因芯片的重復(fù)性及穩(wěn)定性。雜交結(jié)果如下圖，該結(jié)果顯示出芯片不同點樣批次之間和相同點樣批次之內(nèi)的芯片的重復(fù)性和穩(wěn)定性好。
圖4 不同點樣批次雜交圖
Fig.4 Microarray hybridization result of differences sample batches
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圖5 同一點樣批次雜交圖
Fig.5 Microarray hybridization result of same sample batches
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3 討論
本研究根據(jù)檢驗檢疫日常檢測工作對轉(zhuǎn)基因成分的檢出率的統(tǒng)計確定了用于生物芯片檢測的3種植物（大豆、大米、玉米）。通過研究不同轉(zhuǎn)基因植物的特征序列，篩選了17套引物，并分別設(shè)計了相應(yīng)的探針，并建立了一種基于可視晶片體系的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法，能有效的區(qū)分樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因大豆、大米、玉米，該方法檢測靈敏度可達到0.1%，完全滿足現(xiàn)行的歐盟和其他國家轉(zhuǎn)基因檢測要求（歐盟要求農(nóng)產(chǎn)品中含有獲批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分0.9%即為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品）[12]。本研究建立的檢測平臺能通過顯色直接判讀檢測結(jié)果，成本低、時間短、特異性強、靈敏度高，適合食品和食品原料中轉(zhuǎn)基因成分高通量檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
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