一、顯色反應(yīng)和顯色劑
1．顯色反應(yīng)
有色物質(zhì)本身具有明顯的顏色，可直接用于光度分析，但如果被測(cè)組分的顏色很淺或沒(méi)有顏色，則需加入適當(dāng)?shù)脑噭┦怪捎猩镔|(zhì)，這種加入某種試劑使被測(cè)組分變成有色物質(zhì)的反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)。所加入的試劑稱為顯色劑。顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)等，其中以配位反應(yīng)應(yīng)用最廣。對(duì)于顯色反應(yīng)，一般應(yīng)滿足下列要求：
①靈敏度高。吸光光度法一般用于微量組分的測(cè)定。顯色反應(yīng)的靈敏度是選擇顯色反應(yīng)的重要指標(biāo)，而顯色反應(yīng)的靈敏度是用有色化合物的摩爾吸光系數(shù)ε來(lái)衡量的，因此應(yīng)選擇生成有色物質(zhì)的ε較大的顯色反應(yīng)，一般要求ε≥104。
②反應(yīng)能定量完成。生成的有色物質(zhì)組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。只有組成恒定，被測(cè)組分與有色物質(zhì)之間才有定量關(guān)系。
③選擇性好。顯色劑最好只與待測(cè)離子發(fā)生反應(yīng)，其他組分不干擾或干擾易消除。
④顯色清晰。生成的有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，一般要求有色化合物的最大吸收波長(zhǎng)和顯色劑的最大吸收波長(zhǎng)之差，應(yīng)大于60nm。
2．顯色劑
①無(wú)機(jī)顯色劑。許多無(wú)機(jī)試劑可與金屬離子顯色，但多數(shù)顯色反應(yīng)靈敏度不高，選擇性不好，而且生成的有色化合物不夠穩(wěn)定。因此，僅有少數(shù)無(wú)機(jī)顯色劑應(yīng)用于光度分析。目前應(yīng)用較多的主要有硫氰酸鹽、鋁酸按和過(guò)氧化氫等。
②有機(jī)顯色劑。許多有機(jī)試劑能與金屬離子反應(yīng)，生成非常穩(wěn)定的有色金屬螯合物。這些顯色反應(yīng)不僅靈敏度高，而且選擇性也好。另外，許多金屬螯合劑易溶于有機(jī)溶劑，可進(jìn)行萃取比色，從而進(jìn)一步提高了測(cè)定的靈敏度和選擇性。因此，有機(jī)顯色劑在吸光光度分析中得到廣泛的應(yīng)用。
二、影響顯色反應(yīng)的因素
在實(shí)際應(yīng)用中，能夠完全滿足要求的顯色反應(yīng)是比較少的。因此，在初步選定顯色反應(yīng)之后，要認(rèn)真細(xì)致地研究影響顯色反應(yīng)的各種因素，找出顯色反應(yīng)的最佳條件。
1．顯色劑用量
在進(jìn)行顯色時(shí)，為了使顯色反應(yīng)盡可能進(jìn)行完全，一般應(yīng)加入過(guò)量的顯色劑。但有些顯色反應(yīng)，加入過(guò)量顯色劑會(huì)產(chǎn)生副反應(yīng)，對(duì)測(cè)定不利，在這種情況下，顯色劑的加入量應(yīng)嚴(yán)格控制，使標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液生成有色化合物的組成固定。
在擬定新方法時(shí)，顯色劑和其他試劑的加入量都必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，具體方法是：在一系列濃度相同的試液中，加入不同量的顯色劑，在相同條件下分別測(cè)定其吸光度，若顯色劑用量在某范圍內(nèi)所測(cè)得的吸光度不變，就可在此范圍內(nèi)確定顯色劑的加入量。
2.溶液的酸度
溶液的酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響很大，它不僅直接影響著金屬離子和顯色劑的存在形式，而且也影響著有色化合物的組成和穩(wěn)定性。例如Fe3+與磺基水楊酸的配合反應(yīng)，當(dāng)pH=1.8~2.5時(shí)，生成1：1的紫紅色配合物；pH=4~8時(shí)，生成1：2的紅色配合物；pH=8~11.5時(shí)，則生成1：3的黃色配合物。因此，顯色反應(yīng)通常要求在一定酸度下進(jìn)行。適宜的酸度可通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，方法是：固定溶液中被測(cè)組分與顯色劑的濃度，改變?nèi)芤旱膒H，分別測(cè)出溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，pH為橫坐標(biāo)作圖得到的A—pH曲線，曲線上平直部分（吸光度不變）所對(duì)應(yīng)的pH區(qū)間，即為最佳的酸度范圍。
3．顯色時(shí)間
有些顯色反應(yīng)速率很快，瞬間即可完成，并且顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持不變。但大多數(shù)顯色反應(yīng)速率較慢，需要一定的時(shí)間，溶液才能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。因此，應(yīng)根據(jù)具體情況，掌握適當(dāng)?shù)娘@色時(shí)間，在顏色穩(wěn)定的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。
4．顯色溫度
不同顯色反應(yīng)所要求的溫度不一樣。大多數(shù)顯色反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行，但有些顯色反應(yīng)需加熱至一定溫度才能完成。例如，用抗壞血酸作還原劑，以鉬藍(lán)法測(cè)定磷時(shí)，若在室溫下顯色需要1h，而在沸水浴中顯色，10min內(nèi)就可完成。但應(yīng)當(dāng)注意，有些有色化合物在較高溫度下容易分解，不利于測(cè)定。因此，應(yīng)根據(jù)不同的情況，選擇合適的溫度進(jìn)行顯色。
5.溶劑
溶劑的性質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)也有影響。有些有色化合物的離解度，在水中比在有機(jī)溶劑中大，當(dāng)溶液中加入可與水混溶的有機(jī)溶劑時(shí)，可使顏色加深，提高測(cè)定的靈敏度；溶劑對(duì)有色化合物的穩(wěn)定性也會(huì)發(fā)生影響，使顏色改變；某些顯色反應(yīng)的速率也受溶劑的影響。所以，在光度分析中要注意溶劑的選擇。
6．共存離子
共存離子在光度分析中的影響是多方面的，主要表現(xiàn)為：共存離子本身有顏色或與顯色劑反應(yīng)生成有色化合物；在顯色條件下共存離子水解產(chǎn)生沉淀使溶液混濁；與待測(cè)組分或顯色劑形成更穩(wěn)定的配合物，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行完全等。這些影響可用控制酸度，加入掩蔽劑及分離干擾離子等方法加以消除，也可利用選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)和合適的參比溶液來(lái)避免。
總之，在擬定光度分析方法時(shí)，須通過(guò)條件實(shí)驗(yàn)找出合適的條件后再進(jìn)行測(cè)定。
