護(hù)色劑是能與肉及肉制品中呈色物質(zhì)作用，使之在食品加工、保藏等過程中不致分解、破壞，呈現(xiàn)良好色澤的物質(zhì)。我國(guó)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中公布的發(fā)色劑有硝酸鈉（鉀）和亞硝酸鈉（鉀），它們主要用于肉類加工，用于固定和增強(qiáng)肉的紅色，改善肉的感官性狀，并兼具抑制細(xì)菌，尤其是肉毒梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)的作用。但攝入多量亞硝酸鹽進(jìn)入血液后，可使正常的血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧功能，導(dǎo)致組織缺氧，出現(xiàn)頭暈、惡心，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難、昏迷等癥狀，且在一定條件下，亞硝酸鹽可與二級(jí)胺形成具有致癌作用的亞硝胺類化合物，而硝酸鈉（鉀）的毒性主要是在食品中、水中或胃腸道內(nèi)被還原成亞硝酸鹽所致。因此，食品標(biāo)準(zhǔn)除規(guī)定了發(fā)色劑的使用量外，還規(guī)定了殘留量標(biāo)準(zhǔn)。在GB2760-2011中，目前亞硝酸鈉（鉀）在允許使用的食品中的最大添加量為0.15g/kg，殘留量≤30mg/kg（西式火腿類殘留量≤70mg/kg)；硝酸鈉（鉀）在允許使用的食品中的最大添加量為0.5g/kg，殘留量≤30mg/kg（以亞硝酸鈉計(jì)）。
硝酸鹽和亞硝酸鹽測(cè)定方法很多，公認(rèn)的測(cè)定方法為格里斯試劑比色法測(cè)定亞硝酸鹽含量，錫柱法測(cè)定硝酸鹽含量。其他還有示波極譜法、氣相色譜法、熒光法和離子選擇性電極法等。
一、亞硝酸鹽的測(cè)定
亞硝酸鹽的測(cè)定方法包括鹽酸萘乙二胺比色法、極譜法、熒光法等。此外，還包括離子交換色譜法、流動(dòng)分析法、差示脈沖極譜法、毛細(xì)管電泳法、導(dǎo)數(shù)光度法、催化動(dòng)力學(xué)法、氣相色譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)等。我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法為離子色譜法（GB/T5009.33-2010第一法）、分光光度計(jì)法（GB/T5009.33一一2010第二法）、乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定。
1.離子色譜法
試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，采用相應(yīng)的方法提取和凈化，以氫氧化鉀溶液為淋洗液，陰離子交換柱分離，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。
不同樣品處理方法如下。
(1)水果、蔬菜、魚類、肉類、蛋類及其制品、腌魚類、腌肉類及其他腌制品等：稱取試樣勻漿（精確至0.01g，可適當(dāng)調(diào)整試樣的取樣量，以下相同），以水洗入容量瓶中，超聲提取，每隔5min振搖1次，保持固相完全分散。于水浴中放置，取出放置至室溫，加水稀釋至刻度。溶液經(jīng)濾紙過濾后，取部分溶液離心，上清液備用。
(2）乳和乳粉：稱取試樣（精確至0.01g)，置于容量瓶中，加水，搖勻，超聲，加入3％乙酸溶液，于4℃放置20min，取出放置至室溫，加水稀釋至刻度。溶液經(jīng)濾紙過濾，取上清液備用。
取上述備用的上清液，通過0.22μm水性濾膜針頭濾器、C18柱，棄去前面3mL（如果氯離子大于100mg/L，則需要依次通過針頭濾器、C18柱、Ag柱和Na柱，棄去前面7mL)，收集后面洗脫液待測(cè)。
2.分光光度法
亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定。試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標(biāo)法測(cè)得亞硝酸鹽含量。
稱?。ň_至0.01g）制成勻漿的試樣（如制備過程中加水，應(yīng)按加水量折算），置于燒杯中，加飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以水將試樣洗入容量瓶中，于沸水浴中加熱，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。在振蕩上述提取液時(shí)加入亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入乙酸鋅溶液沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻，放置，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。
本方法最低檢出限為1.0mg/kg，本實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)為重蒸餾水。
油脂多的樣品，可冷卻使脂肪凝固后再濾去或撇去脂肪；對(duì)有色樣品，如紅燒肉類，可取濾液于容量瓶中，加氫氧化鋁乳液定容，過濾取其無(wú)色濾液進(jìn)行比色測(cè)定。若加氫氧化鋁乳后還有顏色，可加氫氧化鋁乳液進(jìn)行2次甚至3次脫色，直至無(wú)色為止。
3.其他方法
除以上兩種常見方法外，食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定方法還包括分光光度法、示波極譜法等。分光光度計(jì)法是利用磺胺和N-1一萘基一乙二胺二鹽酸鹽，使亞硝酸鹽顯粉紅色，然后用分光光度計(jì)在538nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。而示波極譜法則是利用樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸性的條件下亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，在弱堿性條件下再與8一1羥基喹啉偶合形成橙色染料，該偶氮染料在汞電極上還原產(chǎn)生電流，電流與亞硝酸鹽的濃度呈線性關(guān)系，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。
二、硝酸鹽的測(cè)定
硝酸鹽可用電極法、氣相色譜法測(cè)定，也可通過被還原為亞硝酸鹽來(lái)定量。
1.離子色譜法
離子色譜法測(cè)定原理、儀器設(shè)備等與離子色譜法亞硝酸鹽的含量一樣。區(qū)別主要在于標(biāo)準(zhǔn)溶液不同，及結(jié)果計(jì)算不同。
2.分光光度計(jì)法（鎬柱法）
樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，溶液通過鎘柱，或加入鎘粉，使其中的硝酸根離子還原成亞硝酸根離子，在弱酸性條件下，亞硝酸根與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與N一1一萘基乙二胺偶合形成紅色染料，測(cè)得亞硝酸鹽總量，由總量減去亞硝酸鹽含量即得硝酸鹽含量。
樣品預(yù)處理：同“亞硝酸鹽的測(cè)定—鹽酸萘乙二胺法”。
硝酸鹽的還原：先以稀氨緩沖液沖洗鎘柱，流速控制在3一5mL/min，取處理過的樣液于燒杯中，加氨緩沖溶液，混合后注入儲(chǔ)液漏斗，使硝酸鹽經(jīng)鎘柱還原，收集流出液，當(dāng)儲(chǔ)液漏斗中的樣液流完后，再加水置換柱內(nèi)留存的樣液。將全部收集液如前再經(jīng)鎘柱還原1次，收集流出液，以水洗滌鎘柱3次，洗滌液一并收集，加水定容。
亞硝酸鈉總量的測(cè)定：取還原后的樣液于比色管中。以下按鹽酸萘乙二胺法測(cè)得亞硝酸鹽總量，由總量減去亞硝酸鹽含量即得硝酸鹽含量。
本方法硝酸鹽最低檢出限為1.4mg/kg。如無(wú)上述鎘柱玻璃管時(shí)，可以25mL酸式滴定管代用。在制取海綿狀和鎘裝填鎘柱時(shí)最好在水中進(jìn)行，勿使鎘粒暴露于空氣中以免氧化。鎘柱填裝好及每次使用完畢后，應(yīng)先用0.1mol/L鹽酸洗滌，再以水洗兩次，鎘柱不用時(shí)用水封蓋，鎘層不得夾有氣泡。
為保證硝酸鹽測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)常檢驗(yàn)鎘柱的還原效率。鎘柱維護(hù)得當(dāng)，使用一年效能尚無(wú)顯著變化。鎘柱還原效率的測(cè)定：取硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入稀氨緩沖液，混勻后按照分析步驟中“硝酸鹽的還原”進(jìn)行操作。取還原后的溶液于比色管中，按照“亞硝酸鹽的測(cè)定”進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得結(jié)果，與加入量相比較，還原效率應(yīng)大于98％為符合要求。
在沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，硫酸鋅溶液的用量不宜過多。否則，在經(jīng)鎘柱還原時(shí)，由于加氯化銨緩沖液而生成Zn(OH)2白色沉淀，堵塞鎘柱，影響測(cè)定。
鎘是有毒元素之一，不要接觸到皮膚，一旦接觸，立即用水沖洗。另外，不要
將含有大量鎘的溶液棄入下水道，應(yīng)處理后棄去。
三、電極測(cè)定法
在0.1mol/L硫酸鉀介質(zhì)中，用硫酸銀去除氯離子的干擾，硝酸根離子濃度在1×10-2~8×10-5mol/L之間，電位值與硝酸根濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，由此可求出樣品中硝酸鹽的含量。
準(zhǔn)確取切碎混勻的樣品置于研缽中，加入少量硫酸鉀溶液磨勻后，用硫酸鉀溶液稀釋，搖勻，離心，吸取上清液，置于小燒杯中，加入硫酸銀，用磁力攪拌器攪拌，靜置后，取部分上清液約置于另一小燒杯中，插入電極，在磁力攪拌下讀取電位值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)液中硝酸鹽的含量。
離子選擇電極法是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法，測(cè)定硝酸鹽的線性范圍寬，在1×10-2~8×10-5mol/L之間，方法簡(jiǎn)單易行，便于掌握和操作，溶液有顏色或混濁時(shí)均不影響測(cè)定，適合于批量分析。
硝酸銀電極使用前應(yīng)在0.01mol/L硝酸鈉溶液中浸泡1h，然后水洗30min至空白電位達(dá)320mV以上。
此法亞硝酸鹽含量占硝酸鹽含量的30％一40％時(shí)，不影響硝酸鹽的測(cè)定，若超過該比例，可適當(dāng)加入一定量的硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，以提高硝酸鹽水平。
四、氣相色譜法
硝酸根可與苯作用生成硝基苯。硝酸根與苯的反應(yīng)需要嚴(yán)格控制。按上面鎘柱法處理樣品，取30mL樣品處理液和20mL苯于分液漏斗中，充分振搖后，靜置，分層，分出水層，收集于100mL三角瓶中，加10mL苯。滴加50mL80％的硫酸，滴加速度以苯剛剛沸騰或?qū)⒁序v為宜，反應(yīng)5min。然后將全部混合物移入分液漏斗中，用碳酸鈉和水洗苯層，收集苯層。然后用氣相色譜法分析生成的硝基苯，以2一氯萘為內(nèi)標(biāo)物，給出一定的峰值和保留時(shí)間，據(jù)此可推算出樣液中亞硝酸鹽和硝酸鹽的濃度。
該方法優(yōu)點(diǎn)是避免了使用致癌物質(zhì)蔡胺類的化合物，有色物質(zhì)也不影響測(cè)定，可測(cè)定10mg/kg以下的硝基苯，回收率達(dá)95％一99%。本方法還可用高錳酸鉀將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，測(cè)定亞硝酸鹽含量。
五、幾種方法的比較
食品中亞硝酸和硝酸鹽檢測(cè)的方法很多，各有利弊。吸光光度法所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉，靈敏度也較高，實(shí)用性和可操作性強(qiáng)，易于在基層單位使用。紫外分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是不經(jīng)分離可直接同時(shí)測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽，具有較好的選擇性，操作簡(jiǎn)便。熒光分析法不受檢測(cè)液本身顏色和混濁及樣品稀釋度的干擾，但操作較復(fù)雜，對(duì)環(huán)境因素敏感，適用范圍不廣。鎘柱法結(jié)果準(zhǔn)確，但是操作復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，不適宜大批量樣品的檢測(cè)，且其還原劑鎘對(duì)環(huán)境構(gòu)成很大威脅。色譜法測(cè)定準(zhǔn)確，但是測(cè)定速度一般，且需昂貴的儀器。離子色譜法具有高靈敏度、選擇性好、操作步驟簡(jiǎn)單、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，適合廣泛推廣和應(yīng)用。離子選擇電極法快速、簡(jiǎn)便，測(cè)定硝酸根的線性范圍較寬，是普通比色法所不能比的，但是該法費(fèi)用較高，影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素較多。極譜法靈敏度較低。
