一、雙指示劑甲醛滴定法
氨基酸含有酸性的COOH基，也含有堿性的一NH2，它們相互作用使氨基酸成為中性的鈉鹽，不能直接用堿液滴定它的梭基。當(dāng)加入甲醛時(shí)，-NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，使COOH基顯示出酸性，可用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。
用此法滴定的結(jié)果表示a一氨基酸態(tài)氮的含量，其精確度僅達(dá)氨基酸理論含量的90%。如果樣品中只含有某一種已知的氨基酸，從甲醛滴定的結(jié)果可算出該氨基酸的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白水解液），則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)，但一般常用此法測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度，當(dāng)水解完成后，滴定值不再增加。但應(yīng)注意，脯氨酸與甲醛作用產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羥基，滴定時(shí)要消耗一些堿，使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，使結(jié)果偏高。
樣品中氨基酸含量根據(jù)下列公式計(jì)算：
X＝[(V2一V1)×C×0.014]/V×100
式中：X—氨基酸含量，g/100mL;
V1—中性紅作指示劑時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL;
V2—百里酚酞作指示劑時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL;
C—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L;
V—樣品液取用量，mL;
0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。
說明及注意事項(xiàng)如下。
(1)此法適用于測(cè)定食品中的游離氨基酸。
(2）固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測(cè)定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測(cè)定。萃取可在50℃水浴中進(jìn)行0.5h即可。
(3)若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測(cè)定，或用電位滴定法進(jìn)行測(cè)定。
(4）與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和COOH基時(shí)的pH值為8.5一9.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。
二、電位滴定法
本法根據(jù)酸度計(jì)指示pH值控制滴定終點(diǎn)，適合有色樣液的檢測(cè)。
樣品中氨基酸含量根據(jù)下列公式計(jì)算：
X＝[(V1一V2)×C×0.014]/（5×V）×100
式中：X—氨基酸含量，g/100mL;
V1—測(cè)定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液，mL;
V2—試劑空白試驗(yàn)加如甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;
C—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，moVL;
V—樣品稀釋液取用量，mL;
0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。
說明及注意事項(xiàng)如下。
(1)本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測(cè)定。
(2）對(duì)于混濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定。
三、茚三酮比色法
氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波波長(zhǎng)為570nm，據(jù)此可以用吸光光度法測(cè)定樣品中氨基酸含量。
樣品中氨基酸含量根據(jù)下列公式計(jì)算：
X=c/(m×1000)×100
式中：X—氨基酸含量，μg/l00g;
c—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基酸的含量，μg;
m—測(cè)定的樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g。
說明及注意事項(xiàng)如下。
茚三酮在放置過程中易被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進(jìn)行純化。方法為：取10g茚三酮溶于40mL熱水中，加入1g活性炭，搖動(dòng)1min，靜置30min，過濾；將濾液放入冰箱中過夜，即出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶，過濾，用2mL冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器中干燥，裝瓶備用。
四、氨基酸自動(dòng)分析儀法
食物蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量?？赏瑫r(shí)測(cè)定天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸16種氨基酸，其最低檢出限為10pmol。
測(cè)定在氨基酸自動(dòng)分析儀上完成，可控制的操作條件包括緩沖液流量、茚三酮流量、柱溫、色譜柱規(guī)格。
上機(jī)樣品液中氨基酸總量根據(jù)下列公式計(jì)算：
N=（c×A1）/A0
式中：N—上機(jī)樣品液中氨基酸量，nmol/50μL;
c—上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)液中氨基酸量，nmol/50μL;
A1—樣品峰面積；
A0—氨基酸標(biāo)準(zhǔn)峰面積。
樣品中氨基酸含量根據(jù)下列公式計(jì)算：
X=(N×f×Mr×100)/(m×V×106)
式中：N—上機(jī)樣品液中氨基酸量，mg/100g;
f—樣品的稀釋倍數(shù)；
Mr—氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量；
m—樣品的質(zhì)量，g;
V—上機(jī)時(shí)的進(jìn)樣量（此處為50μL)。
說明及注意事項(xiàng)如下。
(1)樣品中氨基酸的含量在1.00g/100g以下，保留兩位有效數(shù)字；含量在1.00g/100g以上，保留三位有效數(shù)字。
(2)16種氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量；天冬氨酸133.1;蘇氨酸119.1;絲氨酸105.1；谷氨酸147.1；脯氨酸115.1；甘氨酸75.1；丙氨酸89.1；纈氨酸117.2；蛋氨酸149.2;異亮氨酸131.2；亮氨酸131.2；酪氨酸181.2；苯丙氨酸165.2;組氨酸155.2；賴氨酸146.2；精氨酸174.2。
(3）標(biāo)準(zhǔn)出峰順序和保留時(shí)間見表，標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖。
(4)本法為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食物中氨基酸的測(cè)定方法，適用于食物中的16種氨基酸的測(cè)定，最低檢出限為10pmol。但本方法不適用于蛋白質(zhì)含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類食物的測(cè)定。
