一、供試材料
1．材料的種類及生理狀態(tài)
(1)葉片為分離材料 葉片是使用最廣泛的分離原生質(zhì)體的材料。經(jīng)處理可以促使一些植物的原生質(zhì)體分裂，或者提高原生質(zhì)體再生植株頻率。預(yù)處理包括黑暗處理、低溫處理和預(yù)培養(yǎng)。例如，甘蔗植株在黑暗條件下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂；而龍膽試管苗葉片在4℃下處理后原生質(zhì)體才能分裂。將四倍體和雙單倍體馬鈴薯3～4周齡試管苗上完全展開(kāi)的葉片用于分離原生質(zhì)體，原生質(zhì)體分裂率和再生率高。當(dāng)表皮細(xì)胞不容易去掉時(shí)，應(yīng)將葉片剪成1～2mm大小后進(jìn)行酶解處理。如果在酶解剪碎葉片時(shí)結(jié)合適當(dāng)?shù)恼婵諠B透處理，使酶液進(jìn)入細(xì)胞間隙，能縮短酶解時(shí)間和提高葉肉原生質(zhì)體產(chǎn)量。酶解前將葉片置于無(wú)酶的原生質(zhì)體分離液中一段時(shí)間，使葉肉細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，以利于加入酶液后纖維素酶和果膠酶迅速消化細(xì)胞壁。
(2)愈傷組織的類型 愈傷組織也常常用于分離原生質(zhì)體。在植物組織的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和繼代過(guò)程中出現(xiàn)了多種類型的愈傷組織，這些愈傷組織在顏色、外部形態(tài)、質(zhì)地和生長(zhǎng)狀況等方面都有著明顯的差別。美味獼猴桃愈傷組織大致可分為4種類型：A型愈傷組織生長(zhǎng)快，結(jié)構(gòu)較疏松，外呈瘤狀突起，培養(yǎng)一段時(shí)間后若不繼代往往出現(xiàn)褐化；B型愈傷組織色澤鮮艷，質(zhì)地較松脆或外松內(nèi)實(shí)，易培養(yǎng)，常呈顆粒狀；C型愈傷組織質(zhì)地致密堅(jiān)硬，表面有突起，生長(zhǎng)較慢；D型愈傷組織色澤暗淡，結(jié)構(gòu)松散柔軟，生長(zhǎng)很慢或不生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中常逐漸褐化死亡。A型愈傷組織分離原生質(zhì)體數(shù)量最多，但存活率較低；B型愈傷組織分離的原生質(zhì)體不僅數(shù)量較多，而且存活率也高，是一種最適于分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的愈傷組織；C型愈傷組織分離的植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體數(shù)量較少，但存活率較高；D型愈傷組織分離的原生質(zhì)體數(shù)量較多，但存活率低。因此，就美味獼猴桃而言，愈傷組織的繼代培養(yǎng)和原生質(zhì)體的分離中主要選B型愈傷組織。
與愈傷組織材料一樣，胚性愈傷組織的狀態(tài)對(duì)于原生質(zhì)體的分離也存在差異。桉樹(shù)胚性愈傷組織在發(fā)育過(guò)程中主要以3種狀態(tài)存在：工類為未分化的胚性愈傷組織，形態(tài)為黃色松軟型，可自然散開(kāi)；Ⅱ類為開(kāi)始分化，但是在胚發(fā)育的初級(jí)階段，形態(tài)為黃色和紅色夾雜的愈傷組織，形態(tài)較松軟；Ⅲ類為紅色堅(jiān)硬愈傷組織，這類愈傷組織已分化出大量胚狀體，質(zhì)地特別硬。3類愈傷組織繼代15d后，用于分離原生質(zhì)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I類愈傷組織的原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高；Ⅱ類愈傷組織的原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯下降；Ⅲ類則幾乎沒(méi)有游離出原生質(zhì)體。因此，就桉樹(shù)而言，I類胚性愈傷組織狀態(tài)更適合原生質(zhì)體的分離。
愈傷組織的生理狀態(tài)之所以對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量有大的影響，主要在于年齡較大或分化程度較高的細(xì)胞其細(xì)胞壁厚難于去除，細(xì)胞已液泡化，即使去除細(xì)胞壁，原生質(zhì)體也較易破裂。
對(duì)于一些植物尤其是禾本科植物來(lái)說(shuō)，不容易分離到大量的葉肉原生質(zhì)體，或者當(dāng)葉肉原生質(zhì)體再生細(xì)胞不能持續(xù)分裂時(shí)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞是非常好的分離原生質(zhì)體的材料。與愈傷組織類似，只有生長(zhǎng)分裂旺盛的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞適合于作為分離原生質(zhì)體的材料。此外，禾本科植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的來(lái)源十分關(guān)鍵，用幼胚外植體誘導(dǎo)的胚性愈傷組織建立胚性細(xì)胞系，其原生質(zhì)體再生細(xì)胞能通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株。用非胚性細(xì)胞系分離的原生質(zhì)體，大部分原生質(zhì)體培養(yǎng)后只形成愈傷組織而沒(méi)有形態(tài)發(fā)生的能力。
(3)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)期取火炬松的胚性細(xì)胞懸浮系不同生長(zhǎng)時(shí)期的懸浮細(xì)胞，用酶液處理，分離原生質(zhì)體。結(jié)果表明，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胚性懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均最高。晚松細(xì)胞懸浮系對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體產(chǎn)率和原生質(zhì)體存活率也較高。由此表明，在以懸浮培養(yǎng)細(xì)胞作為原生質(zhì)體分離的初始材料時(shí)，也要考慮到細(xì)胞的生長(zhǎng)周期對(duì)分離產(chǎn)生的影響。
2．繼代時(shí)間
繼代培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的愈傷組織，分離原生質(zhì)體產(chǎn)率低，較難分離?？赡苁怯捎诩?xì)胞老化及細(xì)胞生理狀態(tài)發(fā)生改變所致；也可能是細(xì)胞次生代謝物積累過(guò)多，使細(xì)胞生理活性降低。而繼代培養(yǎng)時(shí)間短，愈傷組織因轉(zhuǎn)代后恢復(fù)生長(zhǎng)不久，形成的新細(xì)胞團(tuán)較少，取材量小，同樣影響原生質(zhì)體的得率，因而在取材時(shí)一定要掌握好取材時(shí)間。
玉米愈傷組織繼代培養(yǎng)16d，分離純化得到的原生質(zhì)體存活率在95％以上；而繼代培養(yǎng)24d，分離純化得到原生質(zhì)體存活率僅為75％左右。說(shuō)明玉米愈傷組織繼代培養(yǎng)16d是分離原生質(zhì)體的較好時(shí)期。繼代培養(yǎng)不同時(shí)間的蘋(píng)果愈傷組織及懸浮培養(yǎng)系分離原生質(zhì)體的效果不同。繼代10～15d的花粉愈傷組織較繼代16～30d的同樣材料分離得到較高產(chǎn)率和存活率的原生質(zhì)體。
人參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)7d繼代一次的材料，分離得到的原生質(zhì)體數(shù)量多，且容易分裂；14d繼代一次的材料，分離得到的原生質(zhì)體少，生理活性較低，不易分裂成細(xì)胞團(tuán)。以羅田甜柿休眠芽莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)繼代10d的愈傷組織可以分離到較高產(chǎn)率和存活率的原生質(zhì)體。而龍眼則以繼代5d的懸浮細(xì)胞分離原生質(zhì)體的效果最好。荔枝胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，以繼代3～4d的細(xì)胞分離的原生質(zhì)體產(chǎn)率和存活率最高。
二、前處理
由生長(zhǎng)在非無(wú)菌條件下的植株上取來(lái)的組織，首先必須進(jìn)行表面消毒。一般來(lái)說(shuō)，消毒方法為器官和組織消毒的常規(guī)方法。根據(jù)一些研究表明，對(duì)禾谷類植物葉片進(jìn)行表面消毒時(shí)，效果最好效率最高的方法是把它們用芐烷銨(Zephiran)(0．1％)一酒精(10％)溶液漂洗5min。
葉片表面消毒的另一種方法是用70％酒精漂洗，然后再在超凈臺(tái)上使葉片表面的酒精蒸發(fā)掉。
要保證酶解能充分進(jìn)行，必須使酶溶液滲入到葉片的細(xì)胞間隙中去，為達(dá)到這個(gè)目的可以采用幾種不同的方法，其中應(yīng)用最廣泛的是撕去葉片的下表皮，然后以無(wú)表皮的一面向下，使葉片飄浮在酶溶液中。如果葉片下表皮撕不掉或很難撕掉則可把葉片或組織切成小塊(約2mm2)，投入到酶溶液中。若與真空滲入相結(jié)合，這種方法不但十分方便，而且也非常有效。據(jù)報(bào)道，若以真空處理3～5min，使酶液滲入葉片小塊，在2h內(nèi)即可把禾谷類植物的葉肉原生質(zhì)體分離出來(lái)。檢測(cè)酶溶液是否已充分滲入的標(biāo)準(zhǔn)，是當(dāng)真空處理結(jié)束后大氣壓恢復(fù)正常，小塊葉片是否下沉。代替撕表皮的另一種有效方法是用石英砂摩擦葉的下表面。在酶處理期間進(jìn)行攪拌或震動(dòng)可以增加培養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體的釋放率和產(chǎn)量。
三、酶及酶解
不同植物種類或同一植物的不同器官以及它們的培養(yǎng)細(xì)胞，由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同，分解細(xì)胞壁所需的酶也不同。例如，葉片及其培養(yǎng)細(xì)胞采用纖維素酶和果膠酶聯(lián)合使用；根尖細(xì)胞以果膠酶為主，附加纖維素酶；花粉母細(xì)胞和四分體小孢子用蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶聯(lián)合；成熟花粉細(xì)胞用果膠酶和纖維素酶聯(lián)合。一般來(lái)說(shuō)以幼苗的葉片、下胚軸等器官為材料游離原生質(zhì)體時(shí)，去壁相對(duì)容易，應(yīng)選用活性較弱的酶，且酶的濃度要低，以愈傷組織懸浮培養(yǎng)系為材料游離原生質(zhì)體時(shí)，應(yīng)選用活性較強(qiáng)的酶。決明子原生質(zhì)體游離時(shí)，果膠離析酶PecolyaseY一23是必需的。離析酶的加入有利于提高葉肉原生質(zhì)體的游離，而果膠酶則很難游離出原生質(zhì)體。蝸牛酶對(duì)茴香胚性細(xì)胞懸浮系原生質(zhì)體的游離是必需的。
除了酶的種類外，酶液含量對(duì)原生質(zhì)體分離效果也有很大影響。如酶液中的纖維素酶和離析酶對(duì)辣椒子葉原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均有重要影響。CellulaseOnozukaR一10含量為
1．5％時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力均最高，高于或低于此含量，原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力均有所下降。而果膠酶MacerozymeR一10對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量、活力的影響不盡一致，酶含量由0．2％增至0．5％時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量大幅度提高，繼續(xù)提高酶的含量，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯下降，原生質(zhì)體的活力則隨酶含量的增加呈下降趨勢(shì)。綜合考慮酶含量對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力的影響，1．5％纖維素酶和0．6％果膠酶組成的酶液最適于辣椒原生質(zhì)體的分離。
用酶解法制備原生質(zhì)體時(shí)應(yīng)根據(jù)酶解液的組成和含量選擇合適的酶解時(shí)間。在同一酶解條件下，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量愈高，但原生質(zhì)體的活力下降，因此應(yīng)盡量降低酶對(duì)原生質(zhì)體的毒害作用，短時(shí)間酶解，獲取大量有活力的原生質(zhì)體。草莓花藥愈傷組織原生質(zhì)體游離時(shí)，在同一酶解條件下，比較了5個(gè)酶解時(shí)間(1h、5h、10h、13h、14h)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解13h后，大部分愈傷組織被酶解，且活力達(dá)67．35％。比較不同酶解時(shí)間對(duì)辣椒原生質(zhì)體的分離效果，發(fā)現(xiàn)酶解時(shí)間在4～10h范圍內(nèi)，隨酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)率顯著提高，酶解10h原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)17．65×106個(gè)／g(鮮重)，繼續(xù)增加酶解時(shí)間，原生質(zhì)體產(chǎn)率明顯下降，同時(shí)可以觀察到酶液中原生質(zhì)體碎片增多?？梢?jiàn)，長(zhǎng)時(shí)間的酶解可導(dǎo)致原生質(zhì)體破壞。同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的酶解還可能對(duì)原生質(zhì)體的存活率造成不利影響。酶解時(shí)間在4～8h時(shí)，原生質(zhì)體存活率無(wú)明顯差異，再繼續(xù)增加酶解時(shí)間，則原生質(zhì)體存活率顯著下降。酶解時(shí)間不同，活原生質(zhì)體的得率有很大差別。
一般在游離植物原生質(zhì)體時(shí)，采用在搖床上振蕩酶解有利于原生質(zhì)體的釋放。進(jìn)行野大麥原生質(zhì)體游離時(shí)以80r／min在搖床上酶解，隨著振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體得率不斷提高，振蕩4h時(shí)得率達(dá)最高，為8×106個(gè)／g，而在靜止條件下酶解4h時(shí)其原生質(zhì)體得率為3．4×105個(gè)／g，僅為振蕩酶解時(shí)的1／24，在振蕩酶解2h后再靜止酶解2h，其得率為7．1×105個(gè)／g，為振蕩酶解時(shí)的1/11。在其他的植物原生質(zhì)體游離時(shí)，也發(fā)現(xiàn)振蕩酶解有利于原生質(zhì)體的釋放。原因可能是低速振蕩增加了酶解液與進(jìn)行酶解的材料的接觸，同時(shí)還增加了氧氣的供應(yīng)，對(duì)原生質(zhì)體的釋放有利。
四、滲透壓穩(wěn)定劑
在原生質(zhì)體制備過(guò)程中，為了防止原生質(zhì)體被破壞，一般要采用高滲溶液，以利于完整原生質(zhì)體的釋放。配制高滲溶液的溶質(zhì)稱為滲透壓穩(wěn)定劑。常用的滲透壓穩(wěn)定劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類等。在降解細(xì)胞壁時(shí)，滲透壓穩(wěn)定劑常和酶制劑混合使用。通常用滲透壓穩(wěn)定劑來(lái)稀釋酶液。滲透壓穩(wěn)定劑中最常用的是甘露醇、蔗糖和山梨醇。如甘露醇常用于煙草、胡蘿卜、柑橘、蠶豆等的原生質(zhì)體制備；蔗糖常用于煙草、月季等植物；山梨醇常用于油菜等植物。
滲透壓穩(wěn)定劑的種類和濃度應(yīng)根據(jù)植物種類不同而異，如同樣采用甘露醇，胡蘿卜的使用濃度為0．56mol／L、柑橘為0．8mol／L、蠶豆為0．7mol／L，煙草的成熟花粉其使用含量為13％。在火炬松的胚性懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離的研究中，以甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑，用酶液(Cellulase Onozuka RS+Cellulase 0nozuka R10+Pectolyase Y一23)分離胚性懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體，結(jié)果表明，以13％的甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑的，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和原生質(zhì)體的活力均最高，分別為8．2×104個(gè)／mg(鮮重)和63．3％。
還有一類是利用無(wú)機(jī)鹽溶液作為滲透壓穩(wěn)定，由CaCl2、MgSO4、KCl或培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽組成。這類滲透壓穩(wěn)定劑的優(yōu)點(diǎn)是原生質(zhì)體的產(chǎn)量比用甘露醇高。缺點(diǎn)是會(huì)降低細(xì)胞壁降解酶的活性，高濃度的無(wú)機(jī)鹽會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，影響培養(yǎng)效果。
五、質(zhì)膜穩(wěn)定劑
添加細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑有利于提高原生質(zhì)體的產(chǎn)率和存活率。細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑的作用是增加完整細(xì)胞質(zhì)膜的數(shù)量，防止細(xì)胞質(zhì)膜被破壞，促進(jìn)原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁和細(xì)胞分裂以形成細(xì)胞團(tuán)。常用的細(xì)胞質(zhì)膜穩(wěn)定劑有葡聚糖硫酸鉀、2一N一嗎啉乙磺酸(MES)、無(wú)機(jī)鈣離子(CaCl2)和磷酸二氫鉀等。葡聚糖硫酸鉀能夠抑制酶液內(nèi)某些酶如RNA酶的活性，有助于質(zhì)膜穩(wěn)定，保護(hù)原生質(zhì)體，對(duì)細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞團(tuán)的形成有促進(jìn)作用。如在煙草的原生質(zhì)體分離時(shí)，在酶液中加入葡聚糖硫酸鉀，洗凈酶液后進(jìn)行培養(yǎng)，原生質(zhì)體很快長(zhǎng)細(xì)胞壁，而且分裂快，容易形成細(xì)胞團(tuán)；而不加葡聚糖硫酸鉀，原生質(zhì)體經(jīng)1周培養(yǎng)后即死亡。0．1%CaCl2·2H2O能為膜蛋白所束縛，提高膜的鈣含量可增加質(zhì)膜穩(wěn)定性。
六、pH值
酶液的pH值對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力影響很大。因植物材料不同所要求的pH值也有差異，一般為pH 5．5～5．8。如果原生質(zhì)體的供體材料是植物組織器官，酶液中應(yīng)加入pH緩沖劑，以維持穩(wěn)定酶液的pH值。一般添加0．05～0．1mol／L磷酸鹽或3．0～5．0mmol／LMES(嗎啉乙磺酸)。
