pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ載體構(gòu)建及在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)*
黃嬌甜，劉廠輝，鐘警，曾艷輝
摘要
背景：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ是細(xì)胞分化重要的調(diào)控因子，通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞的分化。
目的：構(gòu)建pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，為過(guò)氧化物酶體增 殖物激活受體γ受體功能和基于過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ受體靶點(diǎn)的藥物篩選提供分子研究平臺(tái)。 設(shè)計(jì)、時(shí)間及地點(diǎn)：?jiǎn)我粯颖居^察，于2007-09/2008-07在南華大學(xué)附屬一醫(yī)院臨床研究所完成。
材料：選擇雄性2~5月齡新西蘭大白兔，用于分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
方法：應(yīng)用密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁法不斷純化。從正常小鼠的肝組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶 鏈反應(yīng)法獲得過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γcDNA，經(jīng)XhoⅠ，ApaⅠ雙酶切，定向克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1， 構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ。 主要觀察指標(biāo)：經(jīng)酶切分析和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因的完整性和真實(shí)性，脂質(zhì)體介導(dǎo)下 體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率，提取總RNA和總蛋白，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈 反應(yīng)和Western blot檢測(cè)。
結(jié)果：獲得的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因片段經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)構(gòu)建正確， 成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在其中檢測(cè)到目的基因及蛋白表達(dá)。
結(jié)論：實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ重組質(zhì)粒，同時(shí)在轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中獲得了過(guò) 氧化物酶體增殖物激活受體γ的高效表達(dá)。
關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ；基因轉(zhuǎn)染
0引言
過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ是核受體 中的超家族,其從轉(zhuǎn)錄水平參與許多細(xì)胞功能 及病理生理的調(diào)控過(guò)程，包括脂肪細(xì)胞分化、 糖、脂代謝、炎性反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、癌細(xì) 胞的分化形成等[ 1-2]，因而其極有希望成為治療 動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病及腫瘤等疾病 新的藥物靶標(biāo) [3-5] 。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在特定的體內(nèi)外環(huán)境下 可定向誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌 細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等方向分化。近年 來(lái)發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞在分化成熟過(guò)程中可分泌多種 內(nèi)分泌因子，干擾正常的內(nèi)分泌環(huán)境[ 6]，參與某 些心血管疾病的發(fā)生[ 7-9]。
因此，深入了解骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制對(duì)于干預(yù) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化有重要意義。 文章通過(guò)構(gòu)建pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體 增殖物激活受體γ重組質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)體 外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，初步驗(yàn) 證外源性過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因 轉(zhuǎn)染及修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性。
1材料和方法
設(shè)計(jì)：?jiǎn)我粯颖居^察。 時(shí)間及地點(diǎn)：2007-09/2008-07在南華大 學(xué)附屬一醫(yī)院臨床研究所完成。 材料：選擇雄性2~5月齡新西蘭大白兔，體 質(zhì)量2.0~2.5 kg，購(gòu)于南華大學(xué)動(dòng)物部。實(shí)驗(yàn)過(guò) 程中對(duì)動(dòng)物處置方法符合科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā) 布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》 [10] 。
實(shí)驗(yàn)方法：
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)：將大白兔用 速眠新0.1~0.2 mL/kg肌注全身麻醉，無(wú)菌條件 下，16號(hào)骨髓穿刺針于股骨大轉(zhuǎn)子處進(jìn)針， 用肝素化的無(wú)菌注射器抽吸骨髓5 mL，輕輕 鋪于等量的淋巴分離液上，2 000 r/min離心 30 min。此時(shí),離心管中出現(xiàn)4個(gè)層面，用毛細(xì) 吸管輕輕吸出第2層，即白色絮狀層，移入另 一無(wú)菌離心管中，加入PBS 5 mL，2 000 r/min 離心5 min，棄去上清液加入含體積分?jǐn)?shù)為0.1 的胎牛血清培養(yǎng)基5 mL,均勻吹散沉淀后接 種于75 mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為 0.05的CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),于第3天取出 培養(yǎng)瓶給予首次換液,去除未貼壁細(xì)胞。
以后 每3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察其生長(zhǎng) 狀況。觀察細(xì)胞達(dá)80%融合后，加入2.5 g/L胰 蛋白酶消化1∶2傳代，取第2代細(xì)胞應(yīng)用。 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活 受體γ的構(gòu)建：取正常小鼠肝臟組織，Trizol法 抽提總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為引物，反轉(zhuǎn)錄試 劑盒合成cDNA第1鏈。
設(shè)計(jì)引物：
分別含XhoⅠ和ApaⅠ酶切位點(diǎn)。按照 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒的方法配制聚 合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)體系，以獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)條件為： 94℃3 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃ 1.5 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸10 min， 4℃終止聚合酶鏈反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖凝膠電 泳鑒定聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，隨后經(jīng)電泳，膠回 收預(yù)期條帶。用XhoⅠ和ApaⅠ雙酶切聚合 酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物和載體pEGFP-N1，電泳純化后 回收過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因和 線性化的pEGFP-N1載體，用T4DNA連接酶連 接過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ基因和線 性化的載體。轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top10菌，用含卡那 霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆。分別挑取數(shù)個(gè)菌 落搖菌過(guò)夜，次日提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析、聚 合酶鏈反應(yīng)鑒定，并送上海生物技術(shù)工程有限 公司測(cè)序。
pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ重組 質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1 d將第2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，分為pEGFP- N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1 空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組。每組3復(fù)孔，每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié) 至2×10 5 。
加1 mL含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清的 L-DMEM培養(yǎng)基。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱 中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%~90%，將15μLpEGFP-N1- 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ和3μL lipofectamine 2000分別溶于150μL無(wú)血清L-DMDM培養(yǎng)基中，室溫 靜止5 min，之后將兩液混合，室溫靜置20 min。加無(wú)血 清培養(yǎng)基于24孔板中，將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗2次, 之后加上述混合液100μL/孔,前后搖勻,室溫5 min,每 孔再補(bǔ)加900μL無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃孵育4~6 h后更換 含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清的L-DMDM培養(yǎng)基。同法將 空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光的表達(dá)：分別在轉(zhuǎn)染后24，48，72 h、
1，2，3和4周，在熒光倒置顯微鏡下觀察、攝影。 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γmRNA表達(dá) 的檢測(cè)：取傳代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，按Trizol 試劑盒說(shuō)明提取總RNA。
采用QIAGEN OneStep反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑 盒反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)條件為：94℃ 4 min,94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min 20 s, 72℃10 min,35個(gè)循環(huán)。10 g/L的瓊脂凝膠電泳。 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ蛋白表達(dá)的 檢測(cè)：收集各組細(xì)胞,用蛋白裂解液和PMSF裂解細(xì)胞, 以提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。BCA試劑測(cè)定蛋白含量，煮沸 5~10 min使蛋白變性；冷卻后上樣,經(jīng)SDS-PAGE，電 泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合，熒光顯影,掃描分析。為 保證每孔加等量蛋白質(zhì)，顯影后的膜重新封閉后,再孵 一抗β-actin做對(duì)照，余后步驟同前述。 主要觀察指標(biāo)：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞中目的基因的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞 中蛋白的表達(dá)。
設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估均為 文章作者，均經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)，未采用盲法評(píng)估。
2結(jié)果
2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況
2.2重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定XhoⅠ和ApaⅠ雙 酶切電泳圖出現(xiàn)約4.7 kb和1.5 kb 2條片斷，和質(zhì)粒載體 及預(yù)計(jì)值大小符合。見(jiàn)圖2。
如圖3所示，轉(zhuǎn)染后24 h即可見(jiàn)發(fā)綠色熒光的細(xì) 胞。48~72 h陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，強(qiáng)度增強(qiáng)，多為明 亮的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率15%~20%。1周后表達(dá)綠 色熒光的細(xì)胞逐漸減少，熒光逐漸減弱。到4周時(shí)， 仍可見(jiàn)散在的熒光。其中pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染兔 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞后，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白均勻地充 滿胞漿和胞核。pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激 活受體γ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，熒光 充滿胞漿和胞核但以胞核最明顯，同時(shí)pEGFP-N1 空載體轉(zhuǎn)染組綠色熒光較pEGFP-N1過(guò)氧化物酶體 增殖物激活受體γ轉(zhuǎn)染組鮮艷?？瞻讓?duì)照組未見(jiàn)熒 光表達(dá)。
2.4轉(zhuǎn)染后細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ mRNA的表達(dá)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示，基 因轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激 活受體γ）出現(xiàn)約189 bp大小的電泳條帶，而空載體 轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pEGFP-N1）和未轉(zhuǎn)染組則未出現(xiàn)，見(jiàn) 圖4。
2.5轉(zhuǎn)染后細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ蛋白 的表達(dá)Western Blot結(jié)果表明，基因轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá) 產(chǎn)物能夠與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ抗體結(jié)合， 具有過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ活性，說(shuō)明構(gòu)建的 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ 能在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，其蛋白產(chǎn)物具有免 疫原活性。
空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)產(chǎn)物均不可與 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ抗體結(jié)合。 提示基因轉(zhuǎn)染組高表達(dá)過(guò)氧化物酶體增殖物激活 受體γ蛋白，空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組不表達(dá)過(guò)氧化物 酶體增殖物激活受體γ蛋白，見(jiàn)圖5。
3討論
過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ配體噻唑烷二 酮類可抑制大脂肪細(xì)胞分泌胰島素抵抗分子-腫瘤壞 死因子γ和胰島素抵抗因子促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化、增 加小脂肪細(xì)胞數(shù)目，增進(jìn)胰島素相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)，加速 外周組織三酰甘油的分解，促進(jìn)脂肪組織中三酰甘油 合成，綜合的結(jié)果使胰島素敏感性提高[ 11]。
新近的研 究表明，活化的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ可抑 制巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子γ和基質(zhì)金 屬蛋白酶9等炎性相關(guān)蛋白的表達(dá)等效應(yīng)，從而顯示 出抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[ 12]；此外，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化 物酶體增殖物激活受體γ配體還在結(jié)腸、乳腺和前列 腺癌等多種腫瘤中表現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)[ 13]。
可以認(rèn)為， 在治療包括胰島素抵抗、高血糖、動(dòng)脈硬化及腫瘤等 多種疾病中，以過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ作為 靶標(biāo)極具應(yīng)用前景。但是對(duì)于過(guò)氧化物酶體增殖物激 活受體γ在胰腺、心肌等組織中的生物學(xué)功能目前無(wú) 深入研究，而在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的作用研究也有 各個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不盡相同[ 14-15]。
因此，研究某些特定 組織中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ的生物學(xué)功 能必將為將來(lái)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ激動(dòng) 劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 由于長(zhǎng)期使用噻唑烷二酮類類藥物可能伴發(fā)浮 腫和體質(zhì)量增加，個(gè)別患者還出現(xiàn)嚴(yán)重的肝毒性等副 作用[ 16]，尋找既保留治療作用又無(wú)毒副作用的選擇性 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ配體或激動(dòng)劑顯得 尤為重要。中藥活性成分蘊(yùn)藏豐富，篩選并研究中藥 單體中可能的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ配體 將為今后開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建pEGFP-N1-過(guò)氧化物酶體增殖物 激活受體γ表達(dá)質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測(cè)過(guò) 氧化物酶體增殖物激活受體γ基因的mRNA、 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ蛋白表達(dá)；同時(shí)觀察轉(zhuǎn)染前后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì) 胞的生長(zhǎng)及增殖，研究結(jié)果表明，pEGFP-N1-過(guò)氧化 物酶體增殖物激活受體γ轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后 24 h就能觀察到綠色熒光，48~72 h陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增 多,強(qiáng)度增強(qiáng),多為明亮的綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率約 20%。
1周后表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞逐漸減少,熒光逐漸 減弱,到4周時(shí),仍可見(jiàn)散在的熒光。作者還觀察到轉(zhuǎn) 染細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本生物學(xué)特性沒(méi)有變化。這說(shuō) 明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可作為過(guò)氧化物酶體增殖物激 活受體γ的受體細(xì)胞，而綠色熒光蛋白基因可作為一 種高效的報(bào)告基因。為了能夠成功轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前一定 要使細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%，采用無(wú)血清、無(wú)抗生 素轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和脂質(zhì)體濃度比例為1∶2到1∶3效果最 佳。進(jìn)一步為研究過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ在 脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；為過(guò)氧化物 酶體增殖物激活受體γ受體功能和基于過(guò)氧化物酶 體增殖物激活受體γ受體靶點(diǎn)的藥物篩選提供分子 研究平臺(tái)。也為進(jìn)一步研究過(guò)氧化物酶體增殖物激活 受體γ在胰島細(xì)胞、脂肪組織和骨骼肌細(xì)胞中的生物 學(xué)功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
作者選擇pEGFP-N1質(zhì)粒作為重組質(zhì)粒的構(gòu)建的 平臺(tái)主要基于以下考慮：
①pEGFP-N1具有較強(qiáng)的啟 動(dòng)子序列和容易克隆的位點(diǎn)，易用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn) 染，研究工作中較為實(shí)用。
②該載體中構(gòu)建有綠色熒 光蛋白基因，轉(zhuǎn)染成功后可表達(dá)綠色熒光蛋白，經(jīng) 488 nm藍(lán)光激發(fā)發(fā)出綠色熒光，是較為理想的報(bào)告基 因。
③其中含有SV40ori復(fù)制元件，有可能隨宿主細(xì) 胞分裂跟隨胞漿遺傳給子代細(xì)胞，可以在一定程度上 保證目的基因穩(wěn)定傳遞。
同時(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是較為成熟的組織工程 種子細(xì)胞，已經(jīng)在多種外源基因的表達(dá)中進(jìn)行了成功 的運(yùn)用，與質(zhì)粒pEGFP-N1的配套使用也有成功的報(bào) 道。干細(xì)胞不僅易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá),而且轉(zhuǎn) 染外源基因并不影響干細(xì)胞多向分化能力和體外增 殖能力，此外,轉(zhuǎn)染后的干細(xì)胞仍然具有很強(qiáng)的體外 增殖能力并可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞分 化。因此，干細(xì)胞由于其具有取材便捷、體外擴(kuò)增能 力強(qiáng)、基因轉(zhuǎn)染效率高、轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)、可自體回 輸從而避免了免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)已成為基因操作 的干細(xì)胞平臺(tái),故實(shí)驗(yàn)選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為目 的基因的受體細(xì)胞，并選擇其為進(jìn)一步藥物研究的模 型。
4參考文獻(xiàn):略
來(lái)源：中國(guó)化學(xué)試劑網(wǎng)
