殼聚糖固定化β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究
李笑梅,胡 維,高 晗,劉 穎
(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,哈爾濱150076)
摘 要:采用交聯(lián)吸附法將β-葡萄糖苷酶固定在殼聚糖上,方法簡(jiǎn)便易行.固定化酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,相比于游離酶上升了10℃,且固定化酶提高了游離酶的熱穩(wěn)定性.固定化酶最適pH值為6. 0,與游離酶相比上升了1. 0,更耐堿.固定化酶對(duì)化學(xué)試劑穩(wěn)定性增強(qiáng),貯藏穩(wěn)定性有顯著提高.固定化酶優(yōu)化了游離酶的部分酶學(xué)性質(zhì),具有一定應(yīng)用價(jià)值.
關(guān)鍵詞:β-葡萄糖苷酶;固定化;酶學(xué)性質(zhì)
中圖分類號(hào):O629 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào): 1672-0946(2010)06-0688-04
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是纖維素分解酶系中重要組成成分之一,能催化水解芳香基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖.白藜蘆醇具有抗癌和抗心血管疾病等多種生物學(xué)功能,是具有廣泛應(yīng)用前景的保健食品功能因子.但白藜蘆醇一般以糖苷形式存在,去掉苷能使白藜蘆醇表現(xiàn)出更高的活性和保健價(jià)值.β-葡萄糖苷酶能夠?qū)邹继J醇糖苷解離成苷元,即白藜蘆醇的存在形式從配糖體形式(糖苷形式)向配基體形式(苷元形式)轉(zhuǎn)換,提高白藜蘆醇的生物活性.β-葡萄糖苷酶是提高白藜蘆醇苷元的關(guān)鍵酶.β-葡萄糖苷酶市場(chǎng)價(jià)格昂貴,且使用壽命和貯藏期短,應(yīng)此工業(yè)化受到很多限制,本文以殼聚糖為原料,研究殼聚糖固定β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性,旨在提高β-葡萄糖苷酶的可應(yīng)用性.
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)材料
對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p-NPG) ,Sigma公司;β-葡萄糖苷酶, Fluka公司;殼聚糖(食品級(jí))和戊二醛等為國(guó)產(chǎn)分析純.
1. 2 實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1 固定化β-葡萄糖苷酶的制備
用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%乙酸配制1∶20(m /V)的殼聚糖溶液,充分溶解,將殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液液中,殼聚糖將凝聚成白色顆粒,過濾收集殼聚糖珠,用蒸餾水洗滌至中性,于35℃烘干后,用pH值為5. 0, 50 mmol/L的檸檬酸緩沖溶液浸泡過夜.取預(yù)處理的殼聚糖載體1. 0 g,加入pH值為6. 0、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1. 5%的戊二醛1 mL, 30℃下水浴振蕩4. 5 h,用上述緩沖液沖洗的交聯(lián)載體,然后加入5 u酶活的β-葡萄糖苷酶液,水浴2 h,于4℃冰箱中吸附5 h,再用緩沖液沖洗抽濾得固定化酶.
1. 2. 2 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定
采用pNPG法測(cè)定β-葡萄糖苷酶活力.以每min水解產(chǎn)生0. 01μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(1u).
1. 2. 3 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)研究
1. 2. 3. 1 固定化酶最適反應(yīng)溫度
在20~70℃的范圍內(nèi),每隔5℃測(cè)定固定化酶和游離酶酶活,比較不同溫度下固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度.
1. 2. 3. 2 固定化酶的熱穩(wěn)定性
取游離酶和固定化酶在30~80℃下水浴保持1 h,經(jīng)流水冷卻至室溫,測(cè)定酶活力.
1. 2. 3. 3 固定化酶最適反應(yīng)pH值
配制50 mmol/L、pH值為3. 0~6. 0的檸檬酸緩沖溶液, 50 mmol/L、pH值為6. 5~8. 0的Tris-HCl緩沖溶液,測(cè)定不同pH值下固定化酶和游離酶的活力,比較不同pH值下固定化酶和游離酶的最佳反應(yīng)pH值.
1. 2. 3. 4 固定化酶pH值穩(wěn)定性
取游離酶和固定化酶在上述不同pH值緩沖液中,室溫靜置3 h后分別測(cè)定酶活力.
1. 2. 3. 5 金屬離子對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響
用pH值為5. 0的50mmol/L的檸檬酸緩沖液配制1. 0 mmol/L的MgC12、ZnSO4、EDTA、NaCl、FeCl3、AlCl3、CaC12、CuSO4、KCl、FeS04、MnS04溶液,用這些含金屬離子的溶液代替檸檬酸緩沖液,測(cè)定固定化酶和游離酶酶活.
1. 2. 3. 6 固定化酶的貯藏穩(wěn)定性
將制備好的固定化酶及游離酶置于棕色磨口試劑瓶中,室溫貯藏,每隔2 d測(cè)定1次酶活.
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2. 1 固定化酶的最適反應(yīng)溫度
在不同的溫度下,分別測(cè)定游離酶與固定酶的酶活力,結(jié)果如圖1所示.游離酶的最適溫度為40℃,固定化β-葡萄糖苷酶的最適溫度為50℃,酶的最適反應(yīng)溫度上升了10℃,固定化酶相比于游離酶更耐高溫.這可能由于固定化載體改變了酶的構(gòu)象,從而改變了酶的催化活性.
2. 2 固定化酶的熱穩(wěn)定性
如圖2所示,在30~40℃范圍內(nèi),游離β-葡萄糖苷酶液活力穩(wěn)定,隨著溫度升高,β-葡萄糖苷酶液的活力直線下降,60℃時(shí)活力損失約88%左右.但固定化酶在30~50℃時(shí)活力都穩(wěn)定,且隨溫度升高酶活力下降緩慢,在80℃時(shí),活力依然保持21.5%,由此可見酶固定化后,對(duì)熱的穩(wěn)定性顯著提高.
2. 3 固定化酶的最適pH值
如圖3所示,游離酶酶液最適反應(yīng)pH值為5.0,而固定化酶的最適反應(yīng)pH值為6. 0,與游離酶相比,經(jīng)固定化后的酶最適反應(yīng)pH值會(huì)發(fā)生變化,這主要是因?yàn)楣潭ɑ瘜?dǎo)致微環(huán)境中微電荷變化.在pH值3. 0~4. 0的范圍內(nèi)游離酶和固定化酶的活力相近,在pH值4. 5~5. 5范圍內(nèi)游離酶酶液活力要高于固定化酶. pH值升高至6. 0以上,固定化酶活力則要顯著高于游離酶.固定化酶的耐堿能力增強(qiáng).
2. 4 固定化酶的pH值穩(wěn)定性
研究結(jié)果顯示(見圖4),游離酶在pH值5.0左右穩(wěn)定性最高,而固定化酶在pH值6.0左右穩(wěn)定性最高,在pH<4.0和pH>5.7時(shí),固定化酶活力大于游離酶活力,由此可看出β-葡萄糖苷酶經(jīng)固定化后在較低和中性偏高的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定性提高.
2. 5 金屬離子對(duì)固定化酶活力的影響試驗(yàn)
考察了幾種常見的酶的激活劑和抑制劑對(duì)β-葡萄糖苷酶酶液和固定化β-葡萄糖苷酶活力的影響,試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5),Mg2+、Zn2+、ED-TA、Na+、Fe3+、Cu2+、K+、Mn2+對(duì)β-葡萄糖苷酶酶液活力有一定的抑制作用,Al3+、Ca2+、Fe2+對(duì)β-葡萄糖苷酶酶液活力幾乎無影響.β-葡萄糖苷酶固定化后Mg2+、Zn2+、K+抑制作用有所降低,而EDTA和Cu2+、Mn2+對(duì)β-葡萄糖苷酶的抑制作用反而加強(qiáng).
2. 6 固定化酶貯藏穩(wěn)定性
研究結(jié)果顯示,固定化β-葡萄糖苷酶活力在貯藏期間緩慢下降, 30 d后殘余活力為73. 8%,與貯藏15 d游離酶活力相當(dāng).
3 討 論
β-葡萄糖苷酶在食品行業(yè)有廣泛應(yīng)用前景,但酶溶液不能回收,反應(yīng)時(shí)間不能控制,采用殼聚糖固定β-葡萄糖苷酶,以顆粒狀反應(yīng)可回收,可反復(fù)利用,且殼聚糖及其分解物無任何毒副作用.殼聚糖固定化β-葡萄糖苷酶制作簡(jiǎn)單,貯藏性好, 30 d后還保持73. 8%活力.固定化酶最適反應(yīng)溫度和對(duì)熱的穩(wěn)定性均有提高.固定化酶最適反應(yīng)pH值偏中性,更有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行.
參考文獻(xiàn):
[1] 李英波,吳國(guó)林.β-葡萄糖苷酶及酶固定化研究進(jìn)展[J].茶葉通報(bào), 2004, 26(1): 21-22.
[2] 邵金輝,韓金祥.β-葡萄糖苷酶在工農(nóng)醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].生命的化學(xué), 2005, 25(1): 22-23.
[3] FABRIS S, MOMO F, RAVAGNANG,etal. Antioxidantprop-erties of resveratrol and piceid on lipid peroxidation in micellesandmonolamellar liposomes[ J]. Biophysical Chemistry, 2008,135(3): 76-83.
[4] 周 濤,王海洪,魏國(guó)乾,等.殼聚糖固定化胰蛋白酶的制備及理化性質(zhì)研究[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 12(1): 28-31.
[5] 張正竹,李英波,蘇二正,等.β-葡萄糖苷酶的蠶絲素蛋白膜固定化及其性質(zhì)研究[ J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(6):6-9.
[6] YAN R, LIN L. Purification and characterization of a glucose-tolerantβ-glucosidase from Aspergillus nigerCCRC31494[J].Biosc.i Biotech. Biochem, 1997, 61(6): 965-970.<
來源：中國(guó)化學(xué)試劑網(wǎng)
