植物淀粉酶活力研究
張 沖
（天津開發(fā)區(qū)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，天津 300457）
摘要 從不同萌發(fā)時(shí)期的小麥中提取淀粉酶，研究在小麥萌發(fā)過程中α-淀粉酶和 β-淀粉酶活力的變化，并在測(cè)定酶活力的過程中加入不同的化學(xué)試劑研究化學(xué)環(huán)境對(duì)2 種淀粉酶活力的影響 。結(jié)果表明，不同濃度的硫酸鈉 、硫酸銅、氯化鈣和氯化鋁對(duì) 2 種淀粉酶有不同的影響。
關(guān)鍵詞 植物；α－淀粉酶；β－淀粉酶；活力；化學(xué)環(huán)境
中圖分類號(hào)Q945.34；S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2011）09-0013-02
淀粉酶包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，其中α-淀粉酶隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等糖類，同時(shí)使淀粉漿的黏度下降，因此又稱為液化酶；β-淀粉酶每次從淀粉的非還原端切下 1 分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。幾乎所有植物中都存在有淀粉酶，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子淀粉酶活力最強(qiáng)。淀粉酶在食品、制酒和制藥等工業(yè)中有廣泛應(yīng)用[1]。本文通過測(cè)定小麥種子不同萌發(fā)階段的淀粉酶活力，尋找 α-淀粉酶和 β-淀粉酶的最適宜提取時(shí)期，并進(jìn)一步研究不同化學(xué)環(huán)境對(duì) 2 種淀粉酶活力的影響，以提高淀粉酶在工業(yè)領(lǐng)域的利用效率。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
供試材料：小麥種子，品種為河北 9411，由天津瑋達(dá)生物公司提供。供試儀器為恒溫培養(yǎng)箱、721E 型分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、800 型臺(tái)式低速離心機(jī)。試驗(yàn)水為蒸餾水。碘貯存液：于約 400 mL 蒸餾水中溶解 1.7 835 g 碘酸鉀、22.5 g碘化鉀，緩緩加人 4.5 mL 濃鹽酸，邊加邊攪拌，再用蒸餾水稀釋至500 mL，充分混勻，貯棕色瓶于冰箱內(nèi)保存[2]。碘應(yīng)用液：貯存液 50 倍稀釋，置冰箱內(nèi)可用 1 個(gè)月。1％淀粉：稱取10 g 可溶性淀粉 ，加入約 50 mL 蒸餾水使之成糊狀后倒入500 mL 沸騰的蒸餾水中，再用蒸餾水洗凈小燒杯內(nèi)淀粉，至少2 次，冷至室溫后用蒸餾水稀釋至 1 L，于冰箱內(nèi)保存 。緩沖液：0.1 moL/L pH值為5.6 的檸檬酸緩沖液 （ 每 20 mL 緩沖液中含0.1 moL/L 檸檬酸 5.5 mL 和 0.1 moL/L 檸檬酸鈉14.5 mL）。0.1 moL/L H2SO4，硫酸鈉 、硫酸銅 、氯化鈣 、氯化鋁各0.5 moL/L。以上試劑不加說明者，均為分析純。
1.2 樣品制備方法
1.2.1 小麥種子的培養(yǎng) 。供試小麥種子經(jīng)蒸餾水漂洗浮選后，用 3 倍體積的蒸餾水浸泡，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱放置 24 h后，轉(zhuǎn)移至鋪有紗布的培養(yǎng)皿中，置于 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天按時(shí)加水。
1.2.2 淀粉酶液的制備。稱取 4 g 小麥種子，置于研缽中，加入少量石英砂和10 mL 蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6 mL 蒸餾水分 2 次將殘?jiān)慈腚x心管 。提取液在室溫下放置提取15~20 min，每隔數(shù)分鐘攪動(dòng) 1 次 ，使其充分提取。然后在 3 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心 10 min，將上清液倒入100 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度 ，搖勻，即為淀粉酶原液。淀粉酶原液經(jīng)過 70 ℃水浴 15 min 鈍化 β-淀粉酶[3]后，用于 α-淀粉酶活力測(cè)定。吸取上述淀粉酶原液 5 mL，放入100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測(cè)定。
1.3 淀粉酶活力測(cè)定方法
在Yoo 改良法[4]基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取 1 mL 相應(yīng)酶液（對(duì)照管準(zhǔn)確吸取 1 mL 蒸餾水），置于比色管中，加入0.1 moL/L pH 值為 5.6 的檸檬酸緩沖液 4 mL 搖勻，于 40 ℃水浴預(yù)熱5 min，準(zhǔn)確加入 1％可溶性淀粉溶液(40 ℃水浴預(yù)熱)1 mL，立即計(jì)時(shí) ，搖勻 ，于 40 ℃水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)5 min 后，加 0.1 moL/L 的 H2SO45mL 終止反應(yīng)。取 0.5 mL 反應(yīng)液加入2 mL 碘應(yīng)用液顯色 ，再加入 3.5 mL 蒸餾水搖勻 ，以2 mL 碘應(yīng)用液加入 4 mL 蒸餾水為空白 ， 在 1 cm 比色皿、620 nm波長下測(cè)吸光度。1 個(gè)酶活力單位（U）定義為 1 g鮮重種子中的淀粉酶40 ℃ 5 min 內(nèi)水解 10 mg 淀粉的酶量。淀粉酶活力按以下公式計(jì)算[5-6]：
淀粉酶活力=[（AB-AU）/AB]×酶液總體積/4
α-淀粉酶活力=25×（AB-AU）/AB
總淀粉酶活力=500×（AB-AU）/AB
β-淀粉酶活力＝總淀粉酶活力-α-淀粉酶活力
上式中：AB為對(duì)照管吸光度，AU為測(cè)定管吸光度。
2 結(jié)果與分析
2.1 萌發(fā)時(shí)間對(duì) 2 種淀粉酶活力的影響
由表1 可知 ，2 種淀粉酶在萌發(fā)過程中活力的變化趨勢(shì)決定了α-淀粉酶活力占總酶活力的比例在萌發(fā)前期迅速升高，在萌發(fā) 3 d 達(dá)到最高值后緩慢下降，而 β-淀粉酶活力占總酶活力的比例在萌發(fā)前期先緩慢下降，在萌發(fā)3 d 達(dá)到最低值后再緩慢上升。在總淀粉酶活力中 β-淀粉酶活力占據(jù)了絕大部分，在萌發(fā)過程中 α-淀粉酶活力占總酶活力的比例最高時(shí)只有6.17%。為盡可能多的獲得 α-淀粉酶，應(yīng)選擇萌發(fā)3 d 的小麥種子進(jìn)行提取 。其變化趨勢(shì)如圖 1 所示。由圖1 可知，小麥種子在浸泡之前的休眠狀態(tài)中 2 種淀粉酶均具有一定的活力，其中α-淀粉酶活力比較微弱，而β-淀粉酶活力較為明顯。浸泡 24 h 后，β-淀粉酶活力表現(xiàn)出了明顯的下降。從萌發(fā)后1 d 開始 2 種淀粉酶活力均穩(wěn)步增長，其中 α-淀粉酶活力增長迅速，并在萌發(fā)的 3 d 活力達(dá)到最大，隨后α-淀粉酶活力開始緩慢下降。與 α-淀粉酶相比，β-淀粉酶活力增長比較平緩且在測(cè)定時(shí)間范圍內(nèi)始終保持增長，但從萌發(fā)5 d 開始增速放緩。
2.2 化學(xué)環(huán)境對(duì) 2 種淀粉酶活力的影響
取萌發(fā)3 d 的小麥種子按 1.2.2 方法制備酶液 。選擇硫酸鈉、硫酸銅、氯化鈣和氯化鋁等 4 種常見的鹽類，分別配制成0.5 moL/L 溶液。在使用 1.3 方法測(cè)定酶活力的過程中，于40 ℃水浴預(yù)熱前移取不同體積的不同鹽類加入到反應(yīng)體系中搖勻，加鹽量如表 2 所示，不足 2 mL 部分用蒸餾水補(bǔ)齊，對(duì)照管相應(yīng)地加入 2 mL 蒸餾水。計(jì)算 α-淀粉酶活力和β-淀粉酶活力后，以不加鹽時(shí)的酶活力為 100%換算成相對(duì)酶活力，結(jié)果見表 2。
由表2 可知，在測(cè)定范圍內(nèi)氯化鈣對(duì) β-淀粉酶活力有一定促進(jìn)作用，加鹽量為 0.3 mL 時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，酶活力可達(dá)無鹽時(shí)的128.93%，該加鹽量下氯化鈣對(duì) α-淀粉酶活力也表現(xiàn)為促進(jìn)，酶活力可達(dá)無鹽時(shí)的 102.90%。但隨著加鹽量增加，氯化鈣對(duì) α-淀粉酶活力表現(xiàn)出緩慢增強(qiáng)的抑制作用。硫酸鈉對(duì) 2 種淀粉酶活力的影響都不大，在相同加鹽量下，α-淀粉酶受到的影響略大于 β-淀粉酶。硫酸銅和氯化
鋁對(duì)2 種淀粉酶活力都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用 ，在低加鹽量下抑制作用就十分明顯，其中加硫酸銅量為 0.3 mL時(shí)的β-淀粉酶活力只有無鹽時(shí)的 67.67%，且隨著加鹽量提高，抑制作用不斷增強(qiáng)。硫酸銅對(duì)2 種淀粉酶的抑制作用要強(qiáng)于氯化鋁，在一定加鹽量范圍內(nèi)β-淀粉酶活力受到硫酸銅和氯化鋁的抑制作用要強(qiáng)于α-淀粉酶。
3 結(jié)論與討論
試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥種子在浸泡之前的休眠狀態(tài)中2種淀粉酶均具有一定活力，其中α-淀粉酶活力比較微弱而β-淀粉酶活力較為明顯。萌發(fā)后 2 種淀粉酶活力均穩(wěn)步增長，α-淀粉酶活力 3 d 達(dá)到峰值并開始下降，其占總酶活力的比例也有相同趨勢(shì)，最高時(shí)達(dá)6.17％。為盡可能多的獲得α-淀粉酶，應(yīng)選擇萌發(fā) 3 d 的小麥種子進(jìn)行提取[6-12]。β-淀粉酶活力始終保持增長。
化學(xué)環(huán)境變化方面，在測(cè)定范圍內(nèi)氯化鈣對(duì) β-淀粉酶活力有一定的促進(jìn)作用；硫酸鈉對(duì) 2 種淀粉酶活力的影響都不大，在相同加鹽量下 α-淀粉酶受到的影響略大于 β-淀粉酶；硫酸銅和氯化鋁對(duì) 2 種淀粉酶活力都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用，在低加鹽量下抑制作用十分明顯 ，在一定加鹽量范圍內(nèi)β-淀粉酶活力受到硫酸銅和氯化鋁的抑制作用要強(qiáng)于α-淀粉酶[13-14]。
4 參考文獻(xiàn)
[1] 馮健飛.α-淀粉酶的應(yīng)用及研究進(jìn)展 [J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技 ，2010（17）：354-355.
[2] 袁建芬.淀粉酶快速比色測(cè)定法[J].交通醫(yī)學(xué)，1998，12（2）：255.
[3] 趙遠(yuǎn)玲.小麥子粒 α-淀粉酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：40-42.
[4] 史永昶 ，姜涌明.五種 α─淀粉酶測(cè)活方法的比較研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1996，23（6）：371-373.
[5] 周景祥，王桂芹，余濤.蛋白酶和淀粉酶活性檢測(cè)方法探討[J].中國飼料，2001（11）：23-24.
[6] 宋陽，王亞瓊，趙麗戀，等.基于淀粉酶活性檢測(cè)的麥芽質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[J].藥學(xué)進(jìn)展，2010，34（9）：411-417.
[7] 賀勝英，唐湘華，洪濤，等.耐酸性 α-淀粉酶的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（20）：10509-10511.
[8] 謝倩，于昕，徐珍珍.玉米種子萌發(fā)過程中淀粉酶活力變化研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（23）：45.
[9] 王琳，段璋玲.Hg2＋脅迫對(duì)小麥幼苗生長及其淀粉酶等同工酶活性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（11）：9-13.
[10] 何士敏，秦家順，高艷梅.幾種玉米種子萌發(fā)期淀粉酶活性變化的研究[J].種子，2010（11）：47-50.
[11] 傅維，呂曉玲.黑米發(fā)芽過程中淀粉酶活力及淀粉含量變化[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：49-52.
[12] 王慧超 ，陳今朝，韓宗先.α-淀粉酶的研究與應(yīng)用[J].重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，27（4）：368-372.
[13] 劉銳鋒，郭希凱，張華.硫化氫對(duì)小麥種子萌發(fā)早期淀粉酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（14）：7218-7219，7226.
[14] 杜紅陽，侯小歌，劉懷攀.亞精胺浸種對(duì)滲透脅迫下玉米種子萌發(fā)和淀粉酶活性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：8-10.
來源：中國化學(xué)試劑網(wǎng)
