生物素標(biāo)記試劑的合成方法改進(jìn)及其在DNA合成中的應(yīng)用
楊明蓉1，2，唐卓2，陳應(yīng)春1
(1．四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041;2．中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041)
摘要:以生物素，4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷，6-氨基-1-己醇，2-氰基乙氧基-雙(N，N-二異丙基)亞磷酰胺等為原料，采用改進(jìn)方法合成了生物素標(biāo)記試劑———［1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基］-2-氰乙氧基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(3)，總收率51．0%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13 C NMR，31 P NMR和MS確證。通過固相亞磷酰胺三酯法，應(yīng)用3合成了一段含有十個堿基的5’-端生物素標(biāo)記的寡核苷酸鏈，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確證。
關(guān)鍵詞:生物素;標(biāo)記;固相亞磷酰胺三酯法;DNA合成
中圖分類號:O626;O627．51文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1005-1511(2012)03-0331-03
近年來，核酸探針雜交技術(shù)在醫(yī)療科研和臨床中被廣泛采用，成為一項直接檢查病原體、癌基因、遺傳病基因突變等的重要手段。用于雜交的核酸探針必須先進(jìn)行標(biāo)記，可分為同位素標(biāo)記和非同位素標(biāo)記兩大類。生物素標(biāo)記的核酸探針屬于非同位素標(biāo)記，它是利用親和素對生物素有極高親和力的原理，分子雜交后用親和素或鏈霉親和素進(jìn)行檢測［1～4］。生物素標(biāo)記探針穩(wěn)定，不失活，并能配用多種檢測系統(tǒng)，簡單方便。
Richard T Pon［5］設(shè)計合成了一種較為理想的生物素標(biāo)記試劑———［1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基］-2-氰乙氧基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基側(cè)鏈顯著增加了生物敏感性［6］，同時3中的二甲氧三苯基增加了穩(wěn)定性，不僅有利于寡核苷酸鏈的合成與純化，而且還可以在DNA合成儀上通過顏色變化檢測連接效率。
為了推進(jìn)3的應(yīng)用，本文改進(jìn)文獻(xiàn)［5］方法，先將生物素與DMTrCl(4，4’-二甲氧基三苯基氯甲烷)反應(yīng)制得1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)生物素(1);1與6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中縮合制得1-N-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2);2與磷試劑2-氰乙氧基-雙(N，N-二異丙基)亞磷酰胺(Ⅰ)［7］反應(yīng)合成了3(Scheme1)，總收率51．0%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13 C NMR，31P NMR和MS確證。
改進(jìn)方法將文獻(xiàn)［5］路線由5步簡化為3步，提高了生物素的轉(zhuǎn)化率，同時避免了昂貴的硅試劑及TBAF(四丁基氟化銨)的使用。
為了驗證改進(jìn)方法的可行性，本文還采用固相亞磷胺三酯法，應(yīng)用3合成了一段含有十個堿基的5’-端Biotin標(biāo)記的寡核苷酸鏈Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(記為Biotin-A10)［8～11］，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS確證。
1·實驗部分
1．1儀器與試劑
Yanaco型顯微熔點儀(溫度計未校正);Brucker-600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Alltech HPLC 1500型液相色譜儀(HPLC);Bruker Daltonics ESI-Bio TOF-Q型高分辨質(zhì)譜儀;ABI 394型DNA合成儀。
硅膠300目～400目，其余所用試劑均為分析純;反應(yīng)均在無水條件下進(jìn)行，所用試劑都需作無水處理。
1．2合成
(1)1的合成在反應(yīng)瓶中依次加入生物素2 g(8．2 mmol)的吡啶(40 mL)溶液，DMTrCl 8．32 g(24．6mmol)，Et3N 828 mg(8．2 mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)250．4 mg(2．08 mmol)，攪拌下于70℃反應(yīng)4 h。濃縮后用氯仿稀釋，分液，有機(jī)相用5%檸檬酸鈉溶液洗滌三次，無水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=3∶97］純化得橙紅色固體1 3．36 g，收率75．0%;1H NMR(DMSO-d6)δ:1．43～1．64(m，6H，CH2)，2．16～2．19(m，4H，SCH2，COCH2)，3．11(m，1H，SCH)，3．72(s，6H，OCH3)，4．27～4．33(m，2H，NCH)，6．70(s，1H，NH)，6．84(d，4H，ArH)，7．22(m，9H，ArH)，11．94(s，1H，CO2H)。
(2)2的合成
在圓底燒瓶中加入1 1．65 g(3．02 mmol)的THF(16 mL)溶液和Et3N 306 mg(3．02 mmol)，攪拌下于0℃緩慢滴加氯甲酸乙酯654 mg(6．04mmol)，滴畢，反應(yīng)1 h;冷卻至－20℃，加入6-氨基-1-己醇608 mg(6．04 mmol)，反應(yīng)過夜。加水稀釋后用氯仿(3×100 mL)萃取，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶20］純化得白色固體2 1．56 g，收率79．3%;1H NMRδ:1．24～1．70(m，14H，CH2)，2．15(t，2H，NCH2)，2．25～2．60(m，2H，COCH2)，3．08～3．23(m，3H，CHS)，3．60(t，2H，OCH2)，3．80(s，6H，OCH3)，4．36(m，2H，NCH)，5．10(s，1H，NH)，5．63(s，1H，NH)，6．81(d，4H，ArH)，7．22(m，9H，ArH)。
(3)3的合成
在反應(yīng)瓶中依次加入2 645 mg(1 mmol)的無水乙腈(10 mL)溶液，四氮唑140 mg(2 mmol)，DIPA(N，N-二異丙胺)242．3 mg(2．4 mmol)和Ⅰ600 mg(2 mmol)，攪拌下于室溫反應(yīng)2 h。用二氯甲烷(200 mL)稀釋，分液，有機(jī)相依次用5%碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:V(Et3N)∶V(氯仿)=1∶19］純化得白色固體3 724 mg，收率85．7%，m．p．148℃～150℃;1H NMRδ:1．21(m，12H，CH3)，1．24～1．90(m，14H，CH2)，2．17(t，2H，NCH2)，2．22～2．60(m，2H，COCH2)，2．65(t，2H，CH2CN)，3．08～3．30(m，3H，CHS)，3．53～3．78(m，4H，OCH2)，3．80(s，6H，OCH3)，4．35(m，2H，CHN)，5．13(s，1H，NH)，5．61(s，1H，NH)，6．81(d，4H，ArH)，7．22(m，9H，ArH);13C NMRδ:11．44，24．55，24．60，24．66，25．23，25．61，26．63，29．50，39．31，42．96，43．01，46．20，54．41，55．23，58．20，59．66，65．40，72．74，112．79，117．77，126．86，127．48，129．74，131．30，135．83，135．91，143．86，158．39，161．81，172．92;31P NMRδ:147．81(s);ESI-MS m/z:868{［M+Na］+}。
1．3 3在合成DNA中的應(yīng)用
在反應(yīng)瓶中加入0．1 mol·L－13的乙腈溶液，置DNA合成儀上，在一段含10個A堿基的寡核苷酸鏈(A10)的5’-端連接3;其N-DMT(N-上的4，4’-二甲基三苯基甲基保護(hù)基)經(jīng)5%三氯乙酸/二氯甲烷脫去后于55℃氨解10 h。經(jīng)反相HPLC純化(條件見表1)得目標(biāo)序列Biotin-A10;ESI-MS m/z:3 474。
2·結(jié)果與討論
本文以文獻(xiàn)［5］工作為基礎(chǔ)，改進(jìn)合成3的方法。由1合成2采用混合酸酐法，利用氨基與羥基反應(yīng)活性的差異一步生成酰胺，避免了羥基的保護(hù)與脫保護(hù)，簡化了反應(yīng)步驟。
由2合成3選用Ⅰ為磷試劑比2-氰基乙氧基-N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺(Ⅱ)［5］的穩(wěn)定性更好、后處理方便、且原料轉(zhuǎn)化率高，3總收率達(dá)51．0%。此外，Ⅰ可大量合成，相對于昂貴的Ⅱ成本大大降低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
本文將3應(yīng)用于合成DNA，成功地制得Bio-tin-A10，充分顯示了3在合成DNA中的廣闊應(yīng)用前景。
為了提高生物素的轉(zhuǎn)化率，DMTrCl，6-氨基-1-己醇，Ⅰ均要過量;因為Ⅰ易被氧化，由2合成3應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行。
參考文獻(xiàn)：略
來源：中國化學(xué)試劑網(wǎng)
