所謂的“全魚(yú)”基因（“all fish”gene）。研究還表明，由魚(yú)的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因組成的“全魚(yú)基因”具有更高表達(dá)效率。由于β-肌動(dòng)蛋白基因（β-actin）啟動(dòng)子為管家型基因的啟動(dòng)子，在許多組織中均有廣泛的啟動(dòng)表達(dá)功能，因此是轉(zhuǎn)基因魚(yú)研究中使用較多的啟動(dòng)子之一[1,2]。草魚(yú)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，國(guó)內(nèi)外對(duì)草魚(yú)研究報(bào)道比較多，但主要集中在人工繁殖、胚胎發(fā)育、病害防治等，對(duì)其分子生物學(xué)上的研究則相對(duì)缺乏。由于草魚(yú)親魚(yú)的個(gè)體大、性成熟周期長(zhǎng)，給其良種選育帶來(lái)了困難，目前尚未獲得遺傳改良的品種或品系。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是改變動(dòng)物遺傳性狀，培育動(dòng)物新品系的有效途徑，且在觀賞魚(yú)培育和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)上具有較好的實(shí)用價(jià)值[3]。
自從第一個(gè)單克隆抗體產(chǎn)生以來(lái)，單抗已廣泛地應(yīng)用于疾病的診治上。為了克服傳統(tǒng)的鼠源性單抗存在的弊端，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展，單克隆抗體的制備技術(shù)取得了比較大的進(jìn)展，包括對(duì)鼠源性單抗的改造、人源性單抗的研制及對(duì)抗體分子結(jié)構(gòu)和功能的改造，尤其是以噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和轉(zhuǎn)基因/轉(zhuǎn)染色體小鼠技術(shù)為代表的人源性單抗制備技術(shù)的研制最為矚目[4]。雜交瘤技術(shù)問(wèn)世并產(chǎn)生出第一個(gè)鼠源性單克隆抗體之后，單克隆抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)單抗）已廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷與治療。然而長(zhǎng)期以來(lái)，臨床上使用的單抗多為鼠源性單抗，存在著很大弊端，最突出地表現(xiàn)在其異源性（異質(zhì)性）所引起的人抗小鼠抗體反應(yīng)（human anti-mouse antibody response, HAMA）或超敏反應(yīng)，降低了單抗的效價(jià)。
定量RT-PCR越來(lái)越廣泛地用于定量基因表達(dá)分析。RT-PCR有可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果，因?yàn)榛蚪M中可能會(huì)產(chǎn)生與一些管家基因常用的轉(zhuǎn)錄物相似的假基因，而造成污染DNA的共擴(kuò)增，它產(chǎn)生與靶基因轉(zhuǎn)錄物相似或者大小相同的擴(kuò)增產(chǎn)物，使mRNA定量表達(dá)分析產(chǎn)生錯(cuò)誤。人們研究了屬于管家基因的肌動(dòng)蛋白的性質(zhì)，常常用它的表達(dá)來(lái)校正定量分析[5]。實(shí)驗(yàn)證明，設(shè)計(jì)準(zhǔn)確的β-肌動(dòng)蛋白的一對(duì)特異性引物，能夠避免擴(kuò)增錯(cuò)誤，特別適用于小量組織樣本的mRNA的定量，如活組織取樣分析。例如人彌散性直腸結(jié)腸癌細(xì)胞中的胸苷酸合酶（TS）mRNA的表達(dá)比正常細(xì)胞高，該細(xì)胞中TS/β-肌動(dòng)蛋白兩種mRNA表達(dá)量的比例在0.0003到0.0182（平均0.0035）[6-8]。有人以β-肌動(dòng)蛋白作為基因表達(dá)的參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)正在產(chǎn)蛋、抱窩和用活血腸肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）免疫的母火雞的垂體細(xì)胞通過(guò)狹線印跡（slot blot）雜交分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抱窩母雞的細(xì)胞質(zhì)PRL mRNA轉(zhuǎn)錄水平（PLR-肌動(dòng)蛋白=3.33）高于產(chǎn)蛋火雞（ PLR-肌動(dòng)蛋白=1.83）。
在中國(guó)水產(chǎn)學(xué)中，轉(zhuǎn)基因魚(yú)技術(shù)是快速改善水產(chǎn)養(yǎng)殖品種特性的有效途徑，而高效啟動(dòng)子區(qū)域的分離和鑒定是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚(yú)載體的重要環(huán)節(jié)。目前在轉(zhuǎn)基因魚(yú)中使用的啟動(dòng)子主要有虹鱒（Oncorhyncus mykiss）金屬硫蛋白等幾種魚(yú)類(lèi)的β-actin基因啟動(dòng)子，并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因魚(yú)研究，結(jié)果表明β-actin基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因的高效表達(dá)[9]，是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚(yú)表達(dá)載體最好的啟動(dòng)子之一。為了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育鯪快速生長(zhǎng)新品系，在克隆了鯪生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子和β-actin基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，采用PCR和一種新的染色體步移法，克隆了鯪β-actin基因啟動(dòng)子，并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子特征進(jìn)行了分析。該基因的成功克隆為構(gòu)建轉(zhuǎn)全魚(yú)基因鯪表達(dá)載體奠定了基礎(chǔ)[10]。
采用高保真PCR技術(shù)從尼羅羅非魚(yú)（Oreochrorrds niloficus）基因組中分離了β-肌動(dòng)蛋白基因片段序列分析顯示該片段包括長(zhǎng)為l643 bp/β-actin基因5? 端側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)和90bp的部分轉(zhuǎn)錄區(qū)序列。啟動(dòng)調(diào)控區(qū)包括一段長(zhǎng)為108bp β-actin基因上游調(diào)控序列、β-actin基因不翻譯的第1個(gè)外顯子和第1個(gè)內(nèi)含子。上游調(diào)控序列中含有與轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)的作用元件：CAAT box，TATA box和CArGbox，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-92、-29和-62處。將尼羅羅非魚(yú)β-actin基因的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)定向克隆到不含啟動(dòng)子的紅色熒光表達(dá)載體中，構(gòu)建了重組熒光表達(dá)載體。重組載體經(jīng)EcoR I 線性化后，采用顯微注射技術(shù)將其注射到唐魚(yú)（Tanichthysalbonubes）的受精卵中，利用熒光顯微鏡觀察外源基因增強(qiáng)型紅色熒光蛋白基因（DsRed2）在唐魚(yú)中的表達(dá)。結(jié)果表明，在熒光顯微鏡下以及普通解剖鏡下均可觀察到紅色熒光，說(shuō)明分離到的羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子序列具有有效的驅(qū)動(dòng)功能[11, 12]。
張殿昌等關(guān)于鯪β-肌動(dòng)蛋白基因和啟動(dòng)子的克隆及序列特征分析中以Actin-FW和Actin-RV為引物，以鯪基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到了1條約3.0 kb的條帶，經(jīng)克隆測(cè)序證實(shí)其為鯪β-actin基因組DNA序列。進(jìn)而克隆鯪β-actin基因啟動(dòng)子序列，將所克隆的鯪β-actin基因（約3,000 kb）和啟動(dòng)子序列（約1,350 kb）利用DNASTAR軟件并借助于手工拼接，共獲得4,351 bp的鯪β-actin基因序列，該基因序列在GenBank的登錄號(hào)為DQ241809。與其他魚(yú)類(lèi)β-actin基因結(jié)構(gòu)相似，鯪β-actin基因也由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。鯪β-actin蛋白具有兩個(gè)核輸出信號(hào)位點(diǎn)（NESl，170~181；NES2，211~222），其為亮氨酸（Leucine）豐富區(qū)域，對(duì)蛋白質(zhì)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的運(yùn)輸起重要作用，說(shuō)明該研究所克隆的鯪β-actin蛋白為細(xì)胞質(zhì)型β-肌動(dòng)蛋白。鯪β-actin基因啟動(dòng)子區(qū)域具有典型的脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特征，-28~-31為T(mén)ATA盒，-55~-64為CArG順勢(shì)調(diào)控元件，-90~-94為CCAAT盒[13]。此外，在啟動(dòng)子的上游區(qū)域還有一個(gè)CRE結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)CArG順式調(diào)控元件，并且在內(nèi)含子1中也含有一個(gè)保守的CArG順勢(shì)調(diào)控元件，對(duì)于增強(qiáng)β-actin基因的表達(dá)具有重要作用[13]。鯪與其他魚(yú)類(lèi)β-actin基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列比對(duì)結(jié)果表明，已知魚(yú)類(lèi)的β-actin基因啟動(dòng)子調(diào)控元件具有高度的保守性，都具有CCAAT盒、CArG基序和TATA盒3個(gè)順勢(shì)調(diào)控元件，且所處的位置相似[14]。
胡文革等在準(zhǔn)噶爾雅羅魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的克隆及其活性功能初步檢測(cè)的研究中證實(shí)了克隆的準(zhǔn)噶爾雅羅魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子SZ21具有啟始綠色熒光蛋白基因在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的活性。通過(guò)對(duì)準(zhǔn)噶爾雅羅魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子的克隆、真核表達(dá)載體pEGFP-N1-AFPⅢ的構(gòu)建及鑒定、準(zhǔn)噶爾雅羅魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子SZ21在BHK-21細(xì)胞中的活性功能鑒定、表達(dá)綠色熒光的BHK-21細(xì)胞中準(zhǔn)噶爾雅羅魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的PCR鑒定[15]，胡文革等認(rèn)為肌動(dòng)蛋白基因是一個(gè)持家基因，在所有的真核生物細(xì)胞中高度保真。β-actin啟動(dòng)子包含典型的CAAT框、TATA框及CArT基序，即CC(A/T)6GG序列。但是，β-actin基因可能還有更多的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控元件，對(duì)于有些特定基因，其轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部也存在著轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，能夠?qū)Σ煌沫h(huán)境條件作出應(yīng)[15]。
綜上所述，β-actin啟動(dòng)子具有廣泛?jiǎn)?dòng)表達(dá)的功能，具有于SV40早期啟動(dòng)子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性。草魚(yú)β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子克隆及其序列分析對(duì)于后續(xù)研究啟動(dòng)子的活性及調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)，對(duì)構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因魚(yú)研究具有重要意義。
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