全國酒廠每年生產(chǎn)的黃水量十分巨大，由于黃水具有髙酸、高BOD、高COD值的特性，如果直接排放，黃水帶來的污染將是很嚴(yán)重的。此外，黃水中含有多種有效成分，是一種可利用的資源，因此，積極尋找黃水的利用途徑顯得尤為重要。黃水中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)為微生物的生長與繁殖提供了充足的條件，作為微生物的培養(yǎng)基也成為了提高黃水利用率的一種方法?？莶菅挎邨U菌作為芽孢桿菌屬的模式種具有很多優(yōu)點(diǎn)包括耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等特性，因而，將枯草芽孢桿菌應(yīng)用于發(fā)酵酒精工業(yè)黃水中，提供了黃水利用的新途徑，為酒精廠黃水的合理利用，節(jié)能減排提供依據(jù)，在生產(chǎn)實(shí)際中具有十分重要的意義與價(jià)值。
1酒精黃水
1.1黃水的形成
黃水為釀酒過程中窖內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物。在濃香型白酒生產(chǎn)中，含水量在52%～55%的入窖酒醅經(jīng)厭氧發(fā)酵，其中的淀粉在各種酶、酵母作用下由糖變酒，并生成二氧化碳，單位酒醅的重量相對減少。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物代謝生成的水與酒醅中未被微生物所利用的水分逐漸沉降，將酒醅中的酸、可溶性淀粉、酵母溶出物、還原糖、單寧及香味前體物質(zhì)等溶于其中并沉積于窖池底部而形成黃水[1]。
發(fā)酵正常的黃水為“老蟑螂色”的膠狀混濁液體。外觀粘稠，并有特殊的臭氣味。品評其味，酸中帶澀。黃水中富含多種有效成份，是一種可利用的資源，黃水中含豐富的有機(jī)酸(尤其是乳酸、丁酸、己酸、乙酸等羧酸含量最多)、醇、醛、酯等呈香味物質(zhì)，同時(shí)還含有氨基酸、糖類、酒精、腐殖質(zhì)、酵母菌體自溶物、微生物菌體以及活細(xì)胞等[2]。
一般情況下每生產(chǎn) 1000kg大曲酒，產(chǎn)生黃水300～400kg，年產(chǎn)萬噸規(guī)模的大曲酒廠要產(chǎn)生黃水3000～4000t，日產(chǎn)量10t 左右[3]。雖然黃水中含有眾多可利用物質(zhì)，但實(shí)際生產(chǎn)中，有不少廠家認(rèn)為黃水是發(fā)酵的副產(chǎn)物，無利用價(jià)值，未能很好利用甚至作為廢物直接排放。黃水的pH 約為3.0～3.5，其BOD：25000～30000mg／L，COD：25000～40000mg／L[3]，若黃水未經(jīng)處理就直接排放掉,對環(huán)境污染很大。
目前我國大部分酒廠對黃水的處理都是將其用于拌糟回窖發(fā)酵或養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥等方面，不僅不能有效利用資源，而且無法從根本上解決發(fā)酵黃水的最終去路問題。因此如何綜合利用黃水資源，如何能夠變廢為寶，徹底解決黃水的去路問題顯得尤為重要。
1.2黃水成分的分析
由于白酒生產(chǎn)企業(yè)使用的釀酒原料、原料配比及原料的質(zhì)量、窖齡和窖池質(zhì)量等因素存在差異。導(dǎo)致各廠家產(chǎn)出的黃水的主要成分及各成分的含量(尤其是各成分的含量)差異較大。資料表明，黃水的成分及其含量較豐富，見表1。不同窖池中的黃水都含有一定數(shù)量的微生物，見表2。
黃水中其他組分[6]，黃水中羰基化合物的生成途徑很多，比如酮酸脫羧、氨基酸脫氨脫羧、醇氧化等反應(yīng)，可生成相應(yīng)的醛、酮。揮發(fā)性含硫化合物，多來自于蛋氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸。芳香族化合物多是酚類化合物，主要由小麥或者制麥曲過程中微生物發(fā)酵產(chǎn)生，或者是在制麥曲過程中形成的中間產(chǎn)物，再由細(xì)菌或者酵母菌發(fā)酵而來。
1.3黃水的營養(yǎng)價(jià)值及其利用基礎(chǔ)
乳酸是世界公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，其在食品、醫(yī)藥、化學(xué)等行業(yè)都有較大的需求量，且其需求量還有逐年擴(kuò)大的趨勢。據(jù)中國食品產(chǎn)業(yè)網(wǎng)的最新報(bào)價(jià)表明，食品級乳酸鈣的最新市場價(jià)高達(dá)7800～9000元／t。黃水中含有豐富的有機(jī)酸(尤其是乳酸、乙酸、己酸、丁酸等羧酸含量最多，一般為白酒酸含量的5- 10倍)，酸度可高達(dá)7度左右。黃水中的乳酸含量高達(dá)97.5～7800mg／100mL，且黃水中還含有高達(dá)5.32～5.4g／100mL的糖[7]，可以通過對黃水進(jìn)行乳酸發(fā)酵，進(jìn)一步提高乳酸的含量。提取黃水中的乳酸或利用黃水中的乳酸制成乳酸鈣，是將黃水變費(fèi)為寶的一個(gè)好方法。
黃水中含有大量的游離氨基酸。研究結(jié)果表明，其中所含游離氨基酸多達(dá)19種，并且含有四分之三以上的動(dòng)物體必需氨基酸，黃水中丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、門冬氨酸含量相對較高[8]，如果將黃水中的氨基酸有效利用，將其加工生產(chǎn)成液體蛋白飼料，不僅能以其價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的品質(zhì)服務(wù)于養(yǎng)殖業(yè)，還能夠解決黃水的去路，實(shí)現(xiàn)資源的綜合利用。
2黃水開發(fā)利用的研究進(jìn)展
近幾年有關(guān)黃水開發(fā)利用的研究報(bào)告主要集中在對黃水進(jìn)行不同程度的處理后用于勾調(diào)各種檔次的白酒和將黃水用于養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥以及拌糟醅回窖發(fā)酵等方面。此外，也出現(xiàn)了其他一些黃水應(yīng)用方法的研究。也都有其各自的應(yīng)用前景。
2.1黃水與白酒生產(chǎn)
黃水經(jīng)簡單的脫色、除臭后，用于勾兌低檔白酒，這樣可以增加原酒中的香味成分，賦予酒體自然協(xié)調(diào)的感覺。由于黃水中雜味較重，一般需要經(jīng)過脫色、過濾等處理后才能作為勾兌白酒的酸性調(diào)味品。它對提高酒體風(fēng)味,賦予酒體濃厚感、醇和感、凈爽感、綿長感，增加酒體的固態(tài)風(fēng)味都有較大的貢獻(xiàn)。
黃水中含有大量的酸類、醇類物質(zhì)，經(jīng)過酯化反應(yīng)可以生成白酒中所需要的酯類物質(zhì)，亦可以酯化后用于勾兌各種檔次的白酒。引人酯化酶可以催化黃水中有機(jī)酸與醇的酯化，如：羅惠波等人[9]在引人酯化酶的基礎(chǔ)上還應(yīng)用了TH—AADY(耐高溫活性干酵母)，黃水經(jīng)酯化后，總酯含量上升率可達(dá)120％～150％，特別是作為濃香型大曲主體香成分的己酸乙酯上升幅度更為明顯，達(dá)9倍。伍顯兵等[10]利用自制的酯化酶對黃水進(jìn)行酯化，取得了很好的效果(將己酸乙酯的含量提高了6倍左右)；張培芳等人[11]通過引入酯化酶的方法，有效地提高了黃水中香味成分的含量(其中黃水中己酸乙酯的含量由70.0mg／L提高到2.49g／L，提高了35.57倍)。
2.2 用于養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥和拌糟醅回窖發(fā)酵
黃水中不僅含有大量的有益微生物菌群，而這些微生物菌群又是白酒生產(chǎn)所用到的酒窖和窖泥中所必需包含的生物體；并且，黃水中含有大量的糖類、蛋白質(zhì)及氨基酸態(tài)氮等微生物生長、繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，白酒廠常常將黃水用于養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥和拌糟醅回窖發(fā)酵。2003年，張建華等人[12]將黃水加大曲粉、酒糟、酒尾、窖泥等發(fā)酵制備的酯化液，然后將酯化液用以拌糟醅回窖發(fā)酵，使糟酒的質(zhì)量得到了明顯提高。黃水也可用于促進(jìn)窖泥酯化老熟、用于修補(bǔ)老窖、進(jìn)行人工培窖，促進(jìn)窖內(nèi)發(fā)酵正常進(jìn)行。
2.3 利用黃水釀造食醋并用作食品防腐劑
黃水中含有大量的乳酸以及醋酸，而且其他的香氣成分含量也與醋十分相近，因此可將黃水進(jìn)行適當(dāng)處理后，直接調(diào)配或再發(fā)酵，加工成具有良好風(fēng)味的食醋。張志剛等人[13]于2005年將黃水粗濾后，添加中高溫大曲，進(jìn)行再次發(fā)酵制取香醋，所得產(chǎn)品不僅符合國家食醋標(biāo)準(zhǔn)，酸度適口、香味醇厚，還具有獨(dú)特的風(fēng)味。
黃水中含有豐富的有機(jī)酸，較高的酸度使其具有良好的防腐效果。同時(shí)，黃水作為糧食發(fā)酵產(chǎn)物具有較高的安全性，因而經(jīng)簡單處理后用作食品防腐劑。楊新力等人對黃水進(jìn)行除雜、脫臭脫色以及濃縮等處理后，將其加工成酸度為8％的黃水處理液添加入醬油，用于其防腐，得到了良好的效果。
2.4提取黃水中的乳酸或者制備乳酸鈣、復(fù)合有機(jī)酸鈣
羅惠波等人[14]針對黃水特性，直接從黃水中選育出優(yōu)良的乳酸菌，并利用黃水中的還原糖和淀粉進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，進(jìn)而提高黃水中乳酸的含量，并取得了良好的成效。王國春等人[15]將黃水中的乳酸提取出來并將其制成乳酸鈣，亦獲得良好得率。但是，黃水中除乳酸外，還有諸多與其性質(zhì)相似的有機(jī)酸，因而在生產(chǎn)純度較高的乳酸或者乳酸鈣時(shí)，存在一定的困難。但是可以考慮利用黃水生產(chǎn)復(fù)合有機(jī)酸鈣而非純粹的乳酸鈣。
2.5利用黃水發(fā)酵制備丙酸
乳酸是黃水有機(jī)酸中含量最高的。同時(shí)黃水中還原糖的含量也特別高，它們都可以作為丙酸發(fā)酵的底物，而且黃水中含有丙酸菌生長所需的氮源。所以，可以利用黃水發(fā)酵生產(chǎn)出產(chǎn)品附加值較高的丙酸。梁慧珍等(2005) [16]利用固定化丙酸菌對黃水中的乳酸和葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵以制取丙酸，其產(chǎn)酸量高達(dá)17.7g／L。
近年來，國內(nèi)外眾多專家對酒精廢水的處理進(jìn)行了大量研究，針對黃水的研究利用主要集中在風(fēng)味組分、氨基酸等氮源以及乳酸這三方面，方法各有千秋，但沒有任何一種能夠完全有效的利用黃水。在資源匱乏的今天，如何能夠變廢為寶，珍惜利用每一種資源，成為亟需解決的問題。
3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵探討
枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，芽孢桿菌屬的一種。該菌是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌，其生理特征豐富多樣，分布廣泛，極易分離培養(yǎng)。因其廣泛分布于土壤及腐敗的有機(jī)物中，且易在枯草浸汁中繁殖，故而得名。
3.1枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特點(diǎn)[17]
桿菌：單個(gè)細(xì)胞通常(0.7～0.8)×(2～3)um，電子顯微鏡測量為(0.54～0.6)×(1.1～3.5)um。革蘭氏陽性菌(G+)，無莢膜，周生有長而豐富的鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。
芽孢：通常(0.6～0.9)×(1.0～1.5)um。橢圓或柱狀，位于菌體中央或稍偏離中央，芽孢形成后菌體膨大不明顯。
菌落：呈圓形，淺褐色，表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，常形成皺醭。
生長溫度：最高為45～55℃，最低為5～20℃。
陽性反應(yīng)：接觸酶；V-P反應(yīng)；在7％的氯化鈉中生長；pH5.7生長；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸；水解淀粉；利用檸檬酸作為碳源；還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；分解酪素；石蕊牛奶產(chǎn)堿胨化。
陰性反應(yīng)：厭氧生長。
卵黃反應(yīng)：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28℃ 4星期水解馬尿酸鹽；利用丙酸鹽并分解酪氨酸。在55℃生長的菌株被0.02％的疊氮化合物抑制。
變化的性質(zhì)：在V-P液中產(chǎn)酸(pH5.0～8.0)；對溶菌酶的抗性；在10％的氯化鈉中生長。
芽孢(endospore 、spore) 是一種休眠體，是產(chǎn)芽孢菌在生長發(fā)育后期在細(xì)胞內(nèi)形成的圓形或橢圓形、厚壁含水量低、抗逆性強(qiáng)的休眠構(gòu)造。由于芽孢不進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)，能經(jīng)受多種環(huán)境傷害，包括高鹽、高滲、熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等試劑的處理。
3.2 芽孢桿菌的作用
芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性菌；有些多肽還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母。其中有一些抗菌肽已被應(yīng)用于治療人類、動(dòng)物和植物的疾病，同時(shí)也可作為生物表面活性劑、食品防腐劑、飼料添加劑和分子生物學(xué)的研究工具?？莶菅挎邨U菌能產(chǎn)生多種抑制植物病原真菌的抗菌物質(zhì)，且對人畜無害，不污染環(huán)境，因而在生物防治植物病害中起著重要的作用[18]。枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，已被越來越多的研制成微生物制劑。其制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色”添加劑，具有廣闊的發(fā)展前景，現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用，顯示出了巨大的社會(huì)效益和生態(tài)效益。
研究表明芽孢桿菌能夠分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶、木聚糖酶等十幾種酶[19]，有助動(dòng)物對飼料的降解、消化，提高飼料利用率。飼料中未被消化的蛋白質(zhì)和一些含氮物質(zhì)在腸道中被大腸桿菌和其他細(xì)菌脫梭生成具有潛在的毒性的腐胺、吲哚、酚類等物質(zhì)。一些芽孢桿菌可產(chǎn)生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氫的酶以及其他抗菌物質(zhì)如過氧化氫，起到殺菌作用，從而減少動(dòng)物體內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生。研究表明一些芽孢桿菌產(chǎn)生SOD酶，SOD可以清除生物體內(nèi)活性氧自由基，減少其對細(xì)胞的毒害作用，使生物體免受傷害。
芽孢桿菌在生長繁殖過程中可以產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，一些脂肪酸可降低動(dòng)物腸道的pH，從而為乳酸菌的生長創(chuàng)造條件，并且抑制病菌的生長。其中丙酸還可以參與三梭酸循環(huán)，為動(dòng)物的新陳代謝提供能量。同時(shí)，能夠產(chǎn)生很高的維生素B和維生素C，為動(dòng)物提供維生素營養(yǎng)。1996年Ozols對106株腸道菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌是維生素B1和維生素B6的主要生產(chǎn)者；1998年倪學(xué)勤等研究表明芽孢桿菌產(chǎn)生有機(jī)酸為機(jī)體提供能量營養(yǎng)的同時(shí)，還促進(jìn)動(dòng)物對鈣、磷、鐵的吸收利用。1992年Jonsson等報(bào)道，芽孢桿菌分泌胞外酶系的同時(shí)還產(chǎn)生抗生素，有助于提高機(jī)體免疫力。
枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)可利用的養(yǎng)料十分豐富，這就決定了其培養(yǎng)發(fā)酵可以產(chǎn)生種類和數(shù)量都極為可觀的酶。芽孢桿菌(Bacilus)不僅能分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等多種酶類。還能在不利的環(huán)境中以芽孢的形式存在，具有耐高溫、耐強(qiáng)酸堿，可經(jīng)受加工過程中眾多工藝的要求，易于儲(chǔ)藏及運(yùn)輸。
3.3枯草芽孢桿菌的應(yīng)用與進(jìn)展
枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種酶類，在食品、農(nóng)業(yè)及飼料養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
在食品行業(yè)，枯草芽孢桿菌酶在動(dòng)物蛋白水解中的骨素加工、植物蛋白水解中的大豆蛋白和大豆肽、乳制品、嬰兒食品等方面己得到廣泛的應(yīng)用；在面包生產(chǎn)工藝中，α-淀粉酶、蛋白酶能有效提高面團(tuán)工藝性能和面包質(zhì)量，并延長面包保鮮期；在玉米深加工領(lǐng)域，采用耐高溫淀粉酶和糖化酶的“淀粉噴射液化”技術(shù)以及“雙酶法"糖化技術(shù)全面帶動(dòng)了我國淀粉糖、味精、檸檬酸等生產(chǎn)工藝的改革；蛋白酶還可用于食品廢渣的處理，使原來被廢棄的動(dòng)植物殘?jiān)靡岳?，如魚蝦等海產(chǎn)品加工剩余的內(nèi)臟、皮殼等下腳料，用蛋白酶處理后經(jīng)提純、濃縮制成調(diào)味劑，添加于食品中，不但提高了食品營養(yǎng)質(zhì)量，增加了經(jīng)濟(jì)效益，而且變廢為寶，減輕了環(huán)境污染[20]。
在農(nóng)業(yè)生防領(lǐng)域，枯草芽孢桿菌生長快、營養(yǎng)簡單、能產(chǎn)生耐熱抗逆芽孢等突出的特征，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，且批量生產(chǎn)工藝簡單，成本較低，使用方便，儲(chǔ)存期長，是一種比較理想的生防微生物。有學(xué)者將微生物和化肥結(jié)合制備成一種復(fù)合生物肥料，將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。迄今為止微生物肥料已在70多個(gè)國家得到推廣應(yīng)用。
枯草芽孢桿菌在飼料行業(yè)也有應(yīng)用。芽孢桿菌制劑是一種常用高效益生菌添加劑?？莶菅挎邨U菌以內(nèi)生孢子形式存于在微生態(tài)制劑中添加進(jìn)入飼料，在進(jìn)入動(dòng)物消化道后，孢子很快復(fù)活，并分泌活性很強(qiáng)的胞外酶，包括蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶等，可以直接提高飼料中營養(yǎng)成分的消化率，降解飼料中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子，減少飼料用量而降低成本，還可以間接刺激機(jī)體本身酶的活性，從而提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能；另外，芽孢桿菌為好氧菌，能通過生物奪氧，扶持瘤胃內(nèi)厭氧菌生長，維持瘤胃內(nèi)微生態(tài)平衡，減少腹瀉和預(yù)防疾病。目前在實(shí)際生產(chǎn)過程中常常根據(jù)有益菌的生物學(xué)作用及微生態(tài)特性，將芽孢桿菌與其他有益菌進(jìn)行合理搭配，優(yōu)化組合進(jìn)行混合發(fā)酵制成復(fù)合菌種制劑并對不同種類的反芻動(dòng)物、不同的生長階段、不同的日糧水平應(yīng)用不同的微生態(tài)制劑，以達(dá)到更好的效果[21]。
3.4影響芽孢桿菌發(fā)酵的因素
枯草芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的模式種具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括耐酸、耐鹽、耐高溫(100℃)及耐擠壓等特性，因而在飼料的加工、貯藏以及通過動(dòng)物胃腸道酸性環(huán)境等的過程中具有較高的穩(wěn)定性能。芽孢桿菌產(chǎn)生的對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有強(qiáng)抗性的芽孢，可忍受各種不良環(huán)境，因此，有必要對芽孢桿菌的產(chǎn)孢特性進(jìn)行研究，以期獲得最佳產(chǎn)孢條件，最終獲得商品化芽孢制劑。
微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要提供合適的發(fā)酵條件，才能使它的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來。優(yōu)化發(fā)酵工藝可以充分發(fā)揮菌種的潛在能力，提高發(fā)酵過程的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。發(fā)酵工藝的研究可從以下兩方面入手。培養(yǎng)基組分的影響：包括碳源、氮源、維生素和輔酶、無機(jī)鹽及微量元素等。發(fā)酵條件的影響：包括溫度、初始pH、初始接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速等。
枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過程中，上述的每一個(gè)因素都至關(guān)重要。其中，培養(yǎng)基除具備微生物必要的營養(yǎng)要素外，還應(yīng)具有合適的比例，所以應(yīng)對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)基優(yōu)化方法多是在單因素水平試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或是在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)理論，能對培養(yǎng)基優(yōu)化取得較好的效果。枯草桿菌所具有的發(fā)酵周期短、可利用養(yǎng)料廣泛、產(chǎn)物豐富等眾多顯著優(yōu)點(diǎn)，使其具有重大的研究意義和廣泛的應(yīng)用前景。
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