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超高效液相色譜法測(cè)定化妝品中孕激素的不確定度評(píng)估

• 發(fā)布日期：2016/10/7 14:18:15 閱讀次數(shù)：1383

• 目前，超高效液相色譜法已廣泛用于化妝品中孕激素的定量檢測(cè)，為了使其符合CNAS-CL07:2006《測(cè)量不確定度評(píng)估和報(bào)告通用要求》，且在測(cè)量數(shù)據(jù)的處理、測(cè)量結(jié)果的表達(dá)和測(cè)量結(jié)果質(zhì)量評(píng)定等方面與國(guó)際接軌，筆者根據(jù)CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，對(duì)超高效液相色譜法測(cè)定化妝品中孕激素(黃體酮)測(cè)量結(jié)果不確定度進(jìn)行了測(cè)量和評(píng)定，為評(píng)定測(cè)量結(jié)果質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

  一、概述

  
  

  1.測(cè)量方法

  《化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007)》規(guī)定采用超高效液相色譜法。

  2.測(cè)量?jī)x器

  Waters公司的ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀。

  3.環(huán)境條件

  溫度:(20±5)℃；相對(duì)濕度:≤75%。

  4.測(cè)量過(guò)程

  稱(chēng)取1.00g試樣于100mL錐形瓶中，加入飽和氯化鈉溶液50mL、硫酸2mL，振蕩溶解后轉(zhuǎn)移至100mL分液漏斗。以環(huán)己烷30mL分3次萃取，離心分離。合并環(huán)己烷并在水浴上餾除。用甲醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移到10mL具塞比色管中，用甲醇稀釋到刻度?；靹蚝?，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)量，用外標(biāo)曲線法定量。

  二、數(shù)學(xué)模型

  測(cè)量結(jié)果計(jì)算公式:(1)

  式中:X——試樣中黃體酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣中黃體酮的質(zhì)量濃度，mg/L；V——試樣定容總體積，mL；M——試樣的質(zhì)量，g。

  
  

  樣品測(cè)定結(jié)果的不確定度除結(jié)果計(jì)算公式中的C、V和M因子的影響外，樣品的均勻性和處理過(guò)程的一致性均會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響，考慮其影響量，公式中需加入其修正因子f_r，式(1)則轉(zhuǎn)化為下列數(shù)學(xué)模型:

  
  

  

  從數(shù)學(xué)模型中可看出，各影響參數(shù)相互獨(dú)立，且各參數(shù)的不確定度直接對(duì)被測(cè)量X的不確定度產(chǎn)生影響，即靈敏系數(shù)等于1，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成，根據(jù)CNAS-GL06:2006之8.2，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u_c(X)表示為

  
  

  三、標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

  
  

  (一)試樣處理液中黃體酮含量測(cè)定值C的不確定度

  1.校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

  校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度是通過(guò)對(duì)空白和標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定，空白溶液調(diào)零，測(cè)得其峰面積(y)的，它包含了峰面積重復(fù)測(cè)量引入的不確定度、儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣量引入的不確定度和曲線擬合相關(guān)性引入的不確定度。測(cè)定結(jié)果如表1所示。

  
  

  

  
  

  <CTSM>表1校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)</CTSM>

  樣品測(cè)量的估計(jì)值是由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用最小二乘法擬合的直線得到的，其擬合校準(zhǔn)曲線參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以利用統(tǒng)計(jì)程序計(jì)算獲得。根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)，用線性回歸方程y=a+bx求出校準(zhǔn)曲線，由最小二乘法分別得到擬合直線的斜率b和截距a:

  
  

  峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差

  
  

  應(yīng)用該曲線進(jìn)行測(cè)量時(shí)，對(duì)被測(cè)樣品處理溶液測(cè)量8次，即p=8，測(cè)得處理液中黃體酮的最佳估計(jì)值為8.82mg/L，于是校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  u_rel(ure)=u(ure)/C=0.082/8.82=0.00929

  2.制備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度評(píng)定

  (1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度評(píng)定

  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)提供的信息，黃體酮的不確定度是0.5%。一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給出的是擴(kuò)展不確定度，屬正態(tài)分布，置信概率p=99.7%，包含因子k=3，為B類(lèi)評(píng)定，其相對(duì)不確定度為

  
  

  (2)稱(chēng)量引入的不確定度評(píng)定

  標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱(chēng)樣量為0.600g，天平檢定證書(shū)給出的質(zhì)量允許誤差y=±1.0mg，其置信概率p=99.7%，屬正態(tài)分布，包含因子k=3，則

  
  標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  (3)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程量器校準(zhǔn)引入的不確定度評(píng)定

  標(biāo)準(zhǔn)工作液制備過(guò)程使用了一系列玻璃量具，按照J(rèn)JG196-2006《常用玻璃量具》檢定規(guī)程的要求，均有相應(yīng)的最大允差，按照矩形分布考慮，，由此估算相對(duì)不確定度分量，如表2所示。

  
  

  

  
  

  <CTSM>表2標(biāo)準(zhǔn)系列配制過(guò)程中量具校準(zhǔn)引入的不確定度</CTSM>

  由表2數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

  
  

  (4)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程溫度變化引入的不確定度評(píng)定

  這是由于溫度缺乏控制而產(chǎn)生的不確定度。根據(jù)制造商提供的信息，該量具已在20℃校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室的溫度在±5℃之間變動(dòng)，該影響引入的不確定度可通過(guò)估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)計(jì)算，液體的體積膨脹明顯大于玻璃的體積膨脹，因此，只需考慮前者即可。水的膨脹系數(shù)為2.1×10^-4℃^-1，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)假設(shè)溫度變化是矩形分布。

  
  由表3數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

  
  

  
  

  

  
  

  <CTSM>表3溫度變化引入的不確定度</CTSM>

  (5)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度的合成

  由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、稱(chēng)量、量具校準(zhǔn)和溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  3.試樣處理液峰面積測(cè)量引入的不確定度評(píng)定

  (1)峰面積重復(fù)測(cè)量引入的不確定度

  
  通過(guò)重復(fù)進(jìn)樣進(jìn)行評(píng)定，它包含試樣進(jìn)樣量的不確定度，該不確定度屬A類(lèi)評(píng)定，由表4數(shù)據(jù)計(jì)算。

  

  
  

  <CTSM>表4重復(fù)進(jìn)樣測(cè)量結(jié)果</CTSM>

  標(biāo)準(zhǔn)偏差為

  
  

  標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  (2)儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度

  根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)和積分儀的一般性能指標(biāo)分析，目前用于液相色譜儀峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1%，取1%，屬B類(lèi)評(píng)定，則該峰面積處理引入的相對(duì)不確定度為

  
  

  (3)試樣處理液峰面積測(cè)量引入的不確定度的合成

  由u_1rel和u_2rel合成的黃體酮試樣處理液峰面積測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  由三、(一).1、2和3的不確定度分量合成的樣品處理液黃體酮含量測(cè)定值C引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  (二)黃體酮總量的回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

  在樣品中加入6mg/L黃體酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，經(jīng)計(jì)算得回收率(n=10)為88.7%，n為得到一個(gè)平均值的測(cè)量次數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%。

  
  

  (三)樣品稱(chēng)量m引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

  樣品稱(chēng)樣量為1.00g，按JJG2053-2006《質(zhì)量計(jì)量器具檢定系統(tǒng)》所給出的質(zhì)量允許差y=±1.0mg，其置信概率p=99.7%，屬正態(tài)分布，包含因子k=3，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  (四)樣品處理后的總體積V引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

  1.具塞比色管校準(zhǔn)引入的不確定度

  樣品處理后用10mL的具塞比色管定容，其最大允許誤差為±0.1mL，按矩形分布考慮，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  相對(duì)不確定度為

  2.溫度變化引入的不確定度

  在分析測(cè)試中測(cè)量的溫度T_t=22℃，量瓶的校準(zhǔn)溫度T₀=20℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10^-4/℃，溫度變化是矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  3.樣品處理后的總體積V引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

  
  

  (五)試樣均勻性和處理操作過(guò)程(f_r)引入的不確定度的評(píng)定

  檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性主要受操作人員樣品處理過(guò)程的一致性、樣品的均勻性和儀器本身的性能因素的影響，該不確定度屬A類(lèi)評(píng)定，采用同一樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。其重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

  
  

  

  
  

  <CTSM>表5重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果</CTSM>

  單次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差:

  
  

  標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

  相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

  
  

  四、合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

  
  

  由表6中的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成:

  
  

  

  
  

  <CTSM>表6相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表</CTSM>

  
  

  五、擴(kuò)展不確定度評(píng)定

  
  

  擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子得到，取置信概率p=95%，則k=2，因此，化妝品中黃體酮含量測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為

  U=u_rel(X)·k=0.022×2=0.044

  由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值計(jì)算試樣中黃體酮含量的最佳估計(jì)值C_x=88.2mg/kg，故其擴(kuò)展不確定度為

  U=88.2mg/kg×0.044=3.89mg/kg

  六、測(cè)量不確定度報(bào)告

  
  

  化妝品中黃體酮測(cè)量結(jié)果:

  C_x=(88.2±3.9)mg/kg(k=2)