DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，這常見于基因的5'-CG-3'序列。DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥嘌呤（7-mG）。絕大多數(shù)DNA 甲基化發(fā)生在CpG二核苷酸上，但有研究表明在植物、小鼠胚胎干細(xì)胞及人的胚胎干細(xì)胞中，在CHG 和CHH ( H 為A，T或C 任一核苷酸) 等三聯(lián)體核苷酸的第一個(gè)胞嘧啶的5'碳原子上也能夠發(fā)生甲基化修飾1 -4。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳，因?yàn)镈NA復(fù)制后，甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化。
Abstract: DNA methylation is one of the earliest modification pathways, CG two nucleotide cytosine of DNA is selectively added to form a 5 - methylcytosine, which is common in the 5'-CG-3 'sequence of the gene. DNA methylation is mainly to form a 5 - methylcytosine (5-mC) and a small amount of N6-methyl-purine (N6-mA), and 7 - methylguanine (7-mG). DNA methylation occurs in the vast majority of the CpG dinucleotide, but studies have shown that in plants, mouse embryonic stem cells and human embryonic stem cells, the CHG and CHH (H is A, T or C either nucleoside acid), 5'C of the first cytosine can be methylated. Methylation sites can be hereditarywith replication of DNA, because newly synthesized unmethylated sites can be methylation by methylase.
Key words: DNA methylation; methylation patterns; methyltransferase; Methylation Profiles
1 DNA甲基化分布模式：
1.1 基因5'、3'端甲基化分布
大多數(shù)基因的5'、3' 側(cè)翼區(qū)DNA甲基化程度較低，除了一些沉默基因外5-6。基因沉寂和DNA的甲基化修飾有關(guān)，在真核生物基因組中的許多基因的5'端分布有長約1KB的“CpG"島序列，可被甲基化修飾，之后，與甲基化修飾的DNA結(jié)合蛋白形成“沉寂"區(qū)段，使其下游基因不能表達(dá)，常見的是基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化。但大多數(shù)基因的啟動(dòng)子是未甲基化的，啟動(dòng)子甲基化往往發(fā)生在基因沉默之后。有研究發(fā)現(xiàn)，在失活的X染色體上，Hprt基因的甲基化發(fā)生在染色體失活后，也就是說，DNA甲基化只是使X染色體失活基因保持失活狀態(tài)7。
1.2 基因內(nèi)部DNA 甲基化分布
雖然多數(shù)基因內(nèi)部CpG 出現(xiàn)頻率較低，但DNA 甲基化程度較高8。而DNA的甲基化往往會(huì)抑制基因的表達(dá)，但有研究表明，基因內(nèi)部DNA甲基化不會(huì)太大程度的影響基因的表達(dá)8。而基因內(nèi)部DNA甲基化是研究有活性的特征之一。在哺乳動(dòng)物基因組中，基因內(nèi)部的高甲基化不影響基因轉(zhuǎn)錄的延伸，而這種甲基化有著重要的生物學(xué)功能，可能與基因的可變剪切有關(guān)。
2 甲基轉(zhuǎn)移酶
根據(jù)催化反應(yīng)的類型, 可以將DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶分為三類: 第一類將腺嘌呤轉(zhuǎn)化成N 6-甲基腺嘌呤; 第二類將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成N 4-甲基胞嘧啶; 第三類將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成C5-甲基胞嘧啶9。DNA的甲基化包括從頭甲基化和維持甲基化，分別由不同的沒來催化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定了三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3。它們的結(jié)構(gòu)如圖1。
2.1 DNMT1
DNMT1是維持甲基化作用的酶，較特異地識(shí)別半甲基化狀態(tài)的DNA，負(fù)責(zé)在細(xì)胞分裂過程中依據(jù)DNA母鏈的甲基化狀態(tài)給新合成的DNA鏈上加上甲基。羧基端為保守的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)催化區(qū)，具有被認(rèn)為是DNA胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)的脯氨酸-2-半胱氨酸二肽，氨基端可能通過對(duì)局部DNA雙螺旋構(gòu)想改變的應(yīng)答，與其他調(diào)節(jié)蛋白的相互作用影響羧基端的催化活性10。
2.2 DNMT2
DNMT2是 Dnmtl變異的純合子11，其可產(chǎn)生多種種類的mRNA,與DNA的結(jié)合能力較強(qiáng),并且在體外可與DNA結(jié)合并阻止DNA的變性, 它不僅存在于有從頭甲基化活性的細(xì)胞,在人和鼠的所有組織，也有少量表達(dá)。這些特性表明Dnmt2可能與 DNA上特異序列結(jié)合,但并不具備甲基轉(zhuǎn)移酶的活性11。
2.3 Dnmt3a和Dnmt3b
D nm t3a 在 ES 細(xì)胞中表達(dá)豐度較高, 成體組織中很低。D nm t3b 在未分化的 ES 細(xì)胞和睪丸組織中高表達(dá), 但是在分化細(xì)胞和成體組織中幾乎檢測不到表達(dá)。這表明，這兩種酶可能與DNA從頭甲基化相關(guān)，也有文章報(bào)道，這兩種酶是CpG位點(diǎn)胞嘧啶特異的DNA重新甲基轉(zhuǎn)移酶，而且，這兩個(gè)基因有互作的關(guān)系12。
3 DNA甲基化檢測方法
隨著對(duì)DNA甲基化研究的深入，開發(fā)出一系列檢測DNA甲基化的方法。其中包括全基因組整體水平的甲基化檢測、特異位點(diǎn)甲基化檢測和發(fā)現(xiàn)新的甲基化位點(diǎn)。
3.1 全基因組DNA甲基化檢測
全基因組整體水平的甲基化檢測可分為兩步：首先是識(shí)別和富集甲基化胞嘧啶，方法有限制性酶切法、染色質(zhì)免疫共沉淀法和酸性亞硫酸輕鹽轉(zhuǎn)換。然后使用高通量測定法獲得被富集的DNA，可通過芯片或大規(guī)模測序得到12。
3.2 特異位點(diǎn)甲基化檢測
3.2.1 限制性內(nèi)切酶的方法
這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶可識(shí)別不同程度的甲基化從而切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進(jìn)行分析。如果酶切位點(diǎn)沒有被甲基化，或甲基化的狀態(tài)不影響酶切活性，那么就會(huì)被切割成小片段，但如果基因組ＤＮＡ 對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)處于該酶敏感的甲基化狀態(tài)，就不會(huì)有小片段產(chǎn)生。
這是較經(jīng)典的甲基化研究方法，實(shí)驗(yàn)簡單、成本低、結(jié)果明確，但存在以下幾個(gè)缺點(diǎn)：1、酶識(shí)別位點(diǎn)的限制性，可能會(huì)忽略非酶切位點(diǎn)的CG序列；2、存在假陽性問題
3.2.2直接測序法
過程是先用重亞硫酸鹽處理，使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變，然后PCR擴(kuò)增所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，與原序列比較,找到發(fā)生甲基化的CpG位點(diǎn)。此方法可靠性及精確度很高，但工作量大，費(fèi)用昂貴。
3.2.3 甲基化特異性的PCR
先用重亞硫酸鹽處理，分別對(duì)重亞硫酸鹽處理過的序列和沒有處理的設(shè)計(jì)引物，引物末端均設(shè)計(jì)至檢測位點(diǎn)結(jié)束，隨后進(jìn)行引物特異性的PCR。最后根據(jù)能否擴(kuò)出PCR產(chǎn)物來確定是否是甲基化位點(diǎn)。
3.3甲基化新位點(diǎn)的尋找
3.3.1 限制性標(biāo)記基因組掃描
限制性內(nèi)切酶NotⅠ識(shí)別位點(diǎn)是：GCGGCCGC，是一種甲基化敏感酶，先用NotⅠ酶消化基因組DNA，甲基化位點(diǎn)不被切割，未甲基化的被切割，標(biāo)記末端、、行一維電泳，隨后用甲基化不敏感的內(nèi)切酶切割，跑二維電泳，此時(shí)，甲基化的部分被切割開并在電泳時(shí)顯帶。
3.3.2 甲基化結(jié)合區(qū)柱層析法
該方法用到的是甲基化結(jié)合蛋白（Methylation Binding Domain, MBD），能夠與甲基化位點(diǎn)特異性結(jié)合。該蛋白一端通過連接多個(gè)組蛋白與凝膠結(jié)合，其另一端的多肽功能區(qū)暴露，這樣當(dāng)待測DNA片段通過時(shí)，含有甲基化位點(diǎn)的DNA即與該蛋白結(jié)合13。
4 DNA甲基化與非編碼RNA的關(guān)系
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20~25個(gè)核苷酸。轉(zhuǎn)錄過程是由RNA聚合酶II介導(dǎo)的，而DNA甲基化會(huì)使表達(dá)RNA聚合酶II的基因沉默，所以，DNA甲基化有可能調(diào)控了miRNAs的表達(dá)。有研究表明，表達(dá)miRNA的基因的啟動(dòng)子的甲基化作用，會(huì)使miRNA的表達(dá)失調(diào)14。
最新的研究發(fā)現(xiàn)，非編碼 RNA 能夠特異的抑制 DNA 甲基化，引入 RNA 能夠選擇性的去甲基化某些基因，從而啟動(dòng)腫瘤抑制因子的表達(dá)，該方法有望能夠治療多種疾病，如癌癥等。來自被研究很透徹的甲基化敏感基因CEBPA的一個(gè)非編碼RNA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1相互作用，阻止在CEBPA位點(diǎn)上的甲基化，從而幫助CEBPA表達(dá)15。文章還指出，DNMT1 和 RNAs之間的功能聯(lián)系發(fā)生在無數(shù)基因位點(diǎn)上。這些發(fā)現(xiàn)支持認(rèn)為非編碼RNA通過與DNMT1相互作用來參與基因組甲基化模式的調(diào)控的假說，同時(shí)也為異常DNA甲基化的點(diǎn)特異性改變提出了一個(gè)潛在治療策略。
5 DNA甲基化圖譜
DNA甲基化圖譜是關(guān)于生物體不同狀態(tài)下DNA甲基化的情況的圖譜，包括在不同的組織及疾病狀態(tài)下，DNA甲基化分布及出現(xiàn)的頻率，來研究DNA甲基化在生物體中的重要作用16。DNA 甲基化圖譜的構(gòu)建方法有很多種，包括以限制性內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的凝膠技術(shù)，其中有限制性標(biāo)記染色組掃描（RLGS）、甲基敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性方法（MSAP）；基于芯片平臺(tái)的DNA甲基化圖譜構(gòu)建技術(shù)，其中有珠陣列（Illumine 公司）、短寡核苷酸芯片（Affymetrix 公司）、長寡核苷酸芯片（NimbleGen 公司和Agilent公司）；基于二代測序的DNA甲基化圖譜構(gòu)建技術(shù)，其中有全基因組重亞硫酸鹽測序（whole genomebisulfite sequencing）、減少表達(dá)的亞硫酸鹽測序（RRBS）、甲基免疫共沉淀測序（MeDIP-seq）17。
DNA 甲基化圖譜在動(dòng)物遺傳育種有重要的意義，可以幫助我們更加全面地了解動(dòng)物的甲基化模式和表觀基因調(diào)控機(jī)理，使我們更加主動(dòng)的應(yīng)用甲基化，為畜牧業(yè)做出貢獻(xiàn)。
6 DNA甲基化的功能
6.1 DNA甲基化與腫瘤
正常情況下, DNA甲基化的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為維護(hù)染色體的完整性、調(diào)節(jié)DNA重組、控制基因表達(dá)及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。但是,當(dāng)DNA甲基化出現(xiàn)異常時(shí)就會(huì)引發(fā)疾病。目前為止，許多研究都證實(shí)DNA的甲基化與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。腫瘤細(xì)胞中的DNA甲基化大部分表現(xiàn)為甲基化水平降低，有小部分區(qū)域發(fā)生的高甲基化。腫瘤的發(fā)生與許多種基因的異常甲基化有關(guān),如抑癌基因、DNA損傷修復(fù)基因及與腫瘤代謝和浸潤相關(guān)的基因。
對(duì)DNA甲基化的研究具有臨床腫瘤學(xué)意義，作為診斷和預(yù)后的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞在惡變之前就已經(jīng)發(fā)生甲基化的改變，因此我們可以根據(jù)甲基化的改變來早期診斷腫瘤，而且腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化是一種可逆改變，所以，可以對(duì)DNA進(jìn)行甲基化與去甲基化，來改善腫瘤的發(fā)生18。
6.2 DNA甲基化與胚胎的發(fā)育
在胚胎發(fā)育過程中，會(huì)發(fā)生兩次全基因組甲基化的改變。精子、卵子結(jié)合后，這兩種高甲基化的配子會(huì)迅速去甲基化，但這種去甲基化作用并不同步發(fā)生。之后還會(huì)發(fā)生一次脫甲基化，發(fā)生于配子發(fā)生之前的原始生殖細(xì)胞13。去甲基化之后，又會(huì)發(fā)生重新甲基化。上述這種去甲基化和重新甲基化作用，可能是為了使胚胎擺脫親本的甲基化模式，從而進(jìn)入正常的發(fā)育程序9。
6.3 DNA 甲基化與宿主防御
真核生物基因組中的寄生序列若發(fā)生改變，如移位和表達(dá)等，會(huì)破壞基因組正常的表達(dá)，給宿主帶來不利影響。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)具有了一套完善的防御體系,可識(shí)別并滅活絕大多數(shù)寄生序列。推測可能與DNA甲基化體系有關(guān)，也有資料表明，DNA甲基化可抑制寄生序列的活動(dòng)，維持宿主正常的生命活動(dòng)19。
7 展望
雖然，目前對(duì)DNA甲基化的了解依然較淺，但DNA 甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的重要手段，不論在動(dòng)物還是植物上，都有重要的意義。從分子以及細(xì)胞水平上闡明DNA甲基化的動(dòng)力學(xué)和遺傳學(xué)也將是我們今后研究的重中之重。
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