摘要 建立高效液相色譜同時(shí)測定黃酒中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉 4 種非法食品添加劑的方法。 黃酒中的待測物質(zhì)經(jīng)提取后，采用 C18柱分離，以甲醇 –乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，在波長 230 nm處用高效液相色譜 –二極管陣列檢測器進(jìn)行測定。 安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的質(zhì)量濃度在 0.5～200.0 μg／mL 范圍內(nèi)與其色譜峰面積的線性關(guān)系良好 (r ＞ 0.999 7)，檢出限為 0.29～0.74 μg／L。 在 0.5，1.0，2.5，5.0，7.5 mg 添加水平時(shí)的平均回收率在 95.6%～104.0%范圍內(nèi)，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.3%～1.5%(n=6)。該方法操作簡便，分離效果好，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適合于黃酒中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的同時(shí)測定。
黃酒是一種低酒精度的釀造酒，含有多種氨基酸及微量元素，被譽(yù)為 “ 液體蛋糕”［1］。 黃酒以大米、黍米等為主要原料，經(jīng)加曲、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成［2］。 著名的黃酒有無錫惠泉酒、紹興加飯酒、丹陽封缸酒、福建龍巖沉缸酒和即墨老酒等［3］。 在黃酒生產(chǎn)過程中生產(chǎn)企業(yè)可以根據(jù)需要適量添加焦糖色素 ( 通過普通法、氨法或亞硫酸銨法制得 )［4］，但禁止添加安賽蜜 ( 乙酰磺胺酸鉀 )、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉［5］，這 4 種食品添加劑分別有增加甜味及防腐作用。 在江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局主導(dǎo)的黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督抽查中，根據(jù)《黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督抽查實(shí)施規(guī)范》要求必須檢測這 4 個(gè)指標(biāo)［6］。 目前，國內(nèi)已有分別測定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和安賽蜜的方法［7–10］，但沒有出臺(tái)同時(shí)測定這 4 種物質(zhì)的國家標(biāo)準(zhǔn)。 分開檢測費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不但不能提高儀器使用效率，還影響整個(gè)監(jiān)督抽查工作的進(jìn)度。 筆者研究了同時(shí)檢測苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和安賽蜜的方法，旨在為大批量的黃酒樣品的快速、準(zhǔn)確檢測與便捷數(shù)據(jù)處理提供參考依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀： 1200LC 型，帶 G1315D 型二極管陣列檢測器和 LC 3D 系統(tǒng)化學(xué)工作站，美國安捷倫科技有限公司；
電子天平： BSA2202S 型，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；
超聲波清洗器： AS20500A 型，天津奧賽恩斯儀器有限公司；
數(shù)顯恒溫水浴鍋： HH–6 型，常州國華電器有限公司；
超純水機(jī)： Direct-Q3 型，法國 Millipore 公司；
黃酒樣品：生產(chǎn)企業(yè)成品庫隨機(jī)抽??；
亞鐵氰化鉀溶液： 106 g／L ；
乙酸鋅溶液： 220 g／L ；
氨水溶液： 0.1% ；
乙酸銨溶液： 0.02 mol／L ；
甲醇：色譜純，美國 Sigma-Aldrich 公司；
苯 甲 酸 溶 液 [GBW(E)100006]、 山 梨 酸 溶 液[GBW(E)100007]、 糖 精 鈉 溶 液 [GBW(E)100008] ：均為 1 mg／m，中國計(jì)量科學(xué)研究院；
安 賽 蜜 溶 液 （BW3510）： 5，50，100，500，1 000μg／mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院；
標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 量取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋配制成所需濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉為 20，40，100，200 μg／mL，安賽蜜為0.5，10，100，200 μg／mL ；實(shí)驗(yàn)所用試劑除注明外均為分析純；
實(shí)驗(yàn)用水：一級(jí)水。
1.2 樣品處理
稱取 5.00 g 試樣于 50 mL 比色管中，在水浴鍋上去除酒精，用 0.1% 氨水調(diào)節(jié) pH 至中性，分別加入 2 mL 亞鐵氰化鉀溶液和 2 mL 乙酸鋅溶液 ( 用于沉淀蛋白質(zhì) )，定容至標(biāo)線，混勻，放置 2 h，取上清液，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，待上機(jī)分析。
1.3 液相色譜條件
色 譜 柱： ZORBAX Eclipse XDB–C18 柱 （250mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；
流動(dòng)相： 甲醇 – 乙酸銨溶液 ( 體積比為 5∶95)，流量為 0.7 mL／min ；柱溫： 30℃；檢測波長： 230 nm ；
進(jìn)樣體積： 10 μL。
1.4 測定方法
按 1.3 測定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液，以待測物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。 同時(shí)記錄待測物質(zhì)的光譜圖，并與標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖 ( 見圖1～圖 4) 對(duì)照進(jìn)行定性分析。
1.5 色譜圖
按 1.3 色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖 5。
2 結(jié)果與分析
2.1 色譜條件試驗(yàn)
2.1.1 檢測波長
在 214，220，225，230 nm 處 分 別 檢 測 混 合 標(biāo)準(zhǔn)溶液，出峰順序依次為安賽蜜 (6.4 min)、苯甲酸(7.9 min)、山梨酸 (11.0 min) 和糖精鈉 (13.2 min)。結(jié)果表明，安賽蜜、山梨酸在 214 nm 處峰高最小，在225，230 nm 處峰高較大；苯甲酸峰高變化不大；糖精鈉在 230 nm 處峰高最小，在 214 nm 處峰高最大。
綜合考慮檢測的適用性和靈敏度，實(shí)驗(yàn)選擇 230 nm為檢測波長。
2.1.2 流動(dòng)相
固定檢測波長，分別考察乙酸銨溶液 (0.02mol／L)、甲醇 – 水、乙腈 – 水、甲醇 – 乙酸銨溶液等作為流動(dòng)相對(duì)于待測物色譜峰的影響。
結(jié)果表明，采用乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)出峰時(shí)間較長； 采用甲醇 – 水溶液、乙腈 – 水作為流動(dòng)相時(shí)幾乎不出峰，基線出現(xiàn)漂移； 采用甲醇 –0.02mol／L 乙酸銨溶液 ( 體積比為 5∶95) 作為流動(dòng)相，能夠很好地分離出 4 個(gè)峰，15 min 內(nèi)就可以完成一次檢測，為了盡量減少黃酒中夾雜物質(zhì) ( 如糖分 )對(duì)色譜柱的污染，實(shí)驗(yàn)設(shè)置檢測時(shí)間為 25 min，以保證一定的時(shí)間沖洗色譜柱。
2.1.3 色譜柱與柱溫
實(shí)驗(yàn)選用安捷倫公司配備的 ZORBAX EclipseXDB–C18 柱進(jìn)行檢測，待測物質(zhì)的峰形和保留時(shí)間都較好，故沒有考慮其它型號(hào)的色譜柱。
在檢測波長和流動(dòng)相固定以后，對(duì)不同的柱溫(25，30，35℃ ) 進(jìn)行考察。 結(jié)果表明，柱溫的改變，對(duì)待測物質(zhì)的保留時(shí)間和靈敏度影響不大，但隨著柱溫降低柱壓有所下降，實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為 30℃，既接近常溫，又有較小的柱壓，可以得到較為理想的色譜峰形和保留時(shí)間。
2.1.4 流速的選擇
固定檢測波長、流動(dòng)相、柱溫、色譜柱，選擇流速為 0.7 mL／min 與 1.0 mL／min 進(jìn)行比較。結(jié)果表明，選用流速為 1.0 mL／min 時(shí)，雖然出峰時(shí)間縮短，但 4 個(gè)峰緊密的排列在一起；選用流速為 0.7mL／min 時(shí)峰形分離效果較好，故選擇流動(dòng)相流速為 0.7 mL／min。
2.2 工作曲線及檢出限
根據(jù)所確定的實(shí)驗(yàn)條件，取系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，其中安賽蜜的濃度為 0.5，10，100，200 μg／mL，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的濃度為 20，40，100，200 μg／mL。 在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度 c 與其對(duì)應(yīng)的峰面積 A 呈良好線性關(guān)系 (r ＞ 0.999 7)，線性方程與線性相關(guān)系數(shù)見表 1。
按 3 倍信噪比除以線性方程的斜率計(jì)算檢出限［11］，本次檢測的儀器噪音為 0.008 1，進(jìn)樣量 10μL。 則各待測物質(zhì)檢出限：安賽蜜為 0.57 μg／L ；苯甲酸為 0.53 μg／L ； 山梨酸為 0.29 μg／L ； 糖精鈉為 0.74 μg／L。
2.3 精密度試驗(yàn)與加標(biāo)回收試驗(yàn)
在 1.3 色譜條件下，以未檢出本底的某黃酒樣品做基質(zhì)，在 0.5，1.0，2.5，5.0，7.5 mg 添加水平時(shí)，每個(gè)添加水平重復(fù) 6 次測定，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)，結(jié)果見表 2。
結(jié)果表明，安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的加標(biāo)平均回收率在 95.6%～104.0% 范圍內(nèi)，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 0.3%～1.5% 范圍內(nèi)，回收率和精密度均滿足實(shí)驗(yàn)要求。
3 結(jié)語
建立了用高效液相色譜儀同時(shí)檢測黃酒中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的方法。 該方法簡便、快速、結(jié)果穩(wěn)定可靠，檢出限、回收率和精密度均符合殘留分析要求，適用于大批量的黃酒樣品的快速準(zhǔn)確檢測與便捷數(shù)據(jù)分析。
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注：華南標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)-國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購平臺(tái)
