小麥種子過(guò)氧化物酶基因wp1的克隆及 在大腸桿菌中的表達(dá)
單麗偉,羅海霞,范三紅,郭藹光
( 西北農(nóng)林科技大學(xué)a.理學(xué)院,b.生命科學(xué)學(xué)院,c.陜西省農(nóng)業(yè)分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊凌712100)
[摘 要] 【目的】克隆小麥種子過(guò)氧化物酶基因wp1,并利用原核系統(tǒng)表達(dá)純化?！痉椒ā客ㄟ^(guò)RT-PCR從小 麥未成熟種子中擴(kuò)增wp1基因cDNA,構(gòu)建His-tag和MBP融合表達(dá)載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。使用直鏈淀 粉親和層析獲得MBP-WP1融合蛋白,并以ABTS為底物檢測(cè)酶活性。【結(jié)果】獲得的wp1基因cDNA編碼一種358 個(gè)氨基酸殘基的蛋白產(chǎn)物,其序列與大麥BP1相似性高達(dá)89%;空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,小麥WP1屬于第三類過(guò)氧 化物酶,具有該家族成員典型的血紅素和鈣離子結(jié)合位點(diǎn);His-Tag融合的WP1主要以包涵體形式存在,而MBP融 合的WP1主要以可溶形式存在,表達(dá)量分別達(dá)到總蛋白的18.2%和34.6%;純化獲得的MBP-WP1融合蛋白可檢測(cè) 到過(guò)氧化物酶活性?！窘Y(jié)論】使用原核系統(tǒng)可高效表達(dá)出可溶性的、具有部分活性的WP1蛋白。
[關(guān)鍵詞] 小麥;種子過(guò)氧化物酶;高GC含量;基因克隆;基因表達(dá)
過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物界,同一個(gè)植物中 通常存在多種過(guò)氧化物酶同工酶,不同同工酶的表 達(dá)模式隨組織、發(fā)育階段和環(huán)境因素的改變而不同。 植物過(guò)氧化物酶(EC 1.11.1.7)參與多種不同的生 理過(guò)程,如機(jī)體內(nèi)毒性過(guò)氧化物的清除、生長(zhǎng)素和細(xì) 胞壁的合成、耐受和對(duì)抗各種生物脅迫和非生物脅 迫等[1-2]。植物中研究最為透徹的是辣根過(guò)氧化物 酶(Horsedimaf peroxidase,HRP),其空間結(jié)構(gòu)已經(jīng) 解析,催化特點(diǎn)也已闡明[3]。
1991年,Rebmann等[4]首次從小麥葉片中克隆 到病源誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶基因。1995年,Baga等[5] 通過(guò)PCR從小麥基因組中克隆到3種小麥過(guò)氧化 物酶基因(pox1、pox2和pox4)全長(zhǎng)序列,以及另外 一種過(guò)氧化物酶基因(pox3)部分序列,RNA分析 結(jié)果表明,其主要在根組織中表達(dá),其中pox2受白 粉病菌誘導(dǎo)在葉片中高豐度表達(dá)[5]。自大規(guī)模 EST測(cè)序以來(lái),UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中已有31種小麥 類過(guò)氧化物酶UniGene,其中僅Ta.5385就對(duì)應(yīng)了 278個(gè)表達(dá)序列。1995年,Converso等[6]從小麥胚 中純化到3種過(guò)氧化物酶組分,并對(duì)其催化特征進(jìn) 行了初步分析;2001年,Caruso等[1]從面粉中純化 到一種陽(yáng)離子過(guò)氧化物酶(WP1),并證明其具有抗 真菌活性;2002年,Yamashita等[7]從面粉中純化到 36 ku陽(yáng)離子過(guò)氧化物酶,其N-末端序列分析與大 麥種子過(guò)氧化物酶(BP1)高度同源;2007年,本研究 組從面粉中純化到一種陽(yáng)離子過(guò)氧化物酶,并對(duì)其 催化特點(diǎn)、熱穩(wěn)定性等進(jìn)行了系統(tǒng)分析,質(zhì)譜分析表 明,該蛋白為小麥種子過(guò)氧化物酶WP1[8]。然而, 關(guān)于WP1基因的克隆和原核表達(dá)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此,本研究以小麥過(guò)氧化物酶表達(dá)序列為依據(jù)設(shè) 計(jì)特異引物,通過(guò)RT-PCR克隆到小麥wp1,并試 圖通過(guò)原核表達(dá)獲得WP1,為進(jìn)一步闡明WP1在 種子發(fā)育中的作用,以及對(duì)面粉加工性能的影響奠 定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 植物材料 從大田采集小麥品種“中國(guó)春” 開(kāi)花后12 d的籽粒,凍存于液氮中待用。 1.1.2 菌株、質(zhì)粒及主要試劑 RNeasy Plant Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司; M-MLV Reverse Tran- scriptase、PrimeSTAR(HS DNA Polymerase購(gòu)自 Takara公司;大腸桿菌菌株T7 Expression和NEB Turbo,限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、amylose resin,DNA Marker和蛋白Marker,均為NEB公司產(chǎn)品;載體 pPCR-Script Amp、pMal-c2x,pET-21a、pET-28a,由陜 西省農(nóng)業(yè)分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;ABTS(2,2-連氮-雙- (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))購(gòu)自Sigma公司。 1.1.3 引 物 參考本研究組對(duì)純化到的WP1的 質(zhì)譜分析結(jié)果,以及GenBank中該基因?qū)?yīng)的表達(dá) 序列標(biāo)簽AL814870和CD915537,設(shè)計(jì)特異引物:
P1:5′-GAG GAG ATG GCT CGT GCT CCT CTG CTA GCA-3′;
P2:5′-ATG GAA TTC GCG GAG CCT CCG GTG GCG CGC-3′;
P3:5′-ATG AAG CTT CTA GCC AAG CCT TTC TGC AGC-3′。
下劃線部分為EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn), 其中P1/P3用于RT-PCR擴(kuò)增wp1 cDNA(包含完 整CDS),P2/P3用于亞克隆wp1成熟肽編碼區(qū)。
1.2 RNA的提取及RT-PCR
RNA提取參考RNeasy Plant Mini Kit說(shuō)明書 進(jìn)行,提取的總RNA經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及 分光光度計(jì)法確認(rèn)RNA的完整性和質(zhì)量。cDNA 第一鏈合成參考M-MLV Reverse Transcriptase說(shuō) 明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為20μL,包括ddH2O 5 μL,5×PrimeSTAR Buffer 4. 0μL, 2 mmol/L dNTP 2μL,二甲基亞砜(DMSO)1.6μL,5 mol/L 甜菜堿4μL,PrimeSTAR(HS DNA Polymeras(5 U/μL) 0.5μL,P1、P3 (10μmol/ L)各0.5μL,cD- NA第一鏈0.5μL。PCR擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性 5 min;95℃變性60 s,65℃退火30 s,72℃延伸90 s,循環(huán)33次;72℃延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
1.3 wp1基因的克隆及序列分析
將1.2中PCR產(chǎn)物直接連接入pPCR-Script Amp載體,轉(zhuǎn)化到NEB Turbo感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白 斑篩選、菌落PCR和酶切鑒定后,送博尚生物技術(shù) 公司測(cè)序確認(rèn)。序列相似性分析通過(guò)NCBI blast 完成;多序列比對(duì)通過(guò)DNAstar的Megalign模塊 的clustalW算法完成,結(jié)果經(jīng)GeneDOC軟件編輯; 三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用Swiss-Model完成(http:// swissmodel.expasy.org),空間結(jié)構(gòu)的可視化使用 Discovery Studio Visualizer2.0軟件處理。
1.4 原核融合表達(dá)載體的構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá) 與純化
用引物P2/P3從pPCR-WP1載體中擴(kuò)增獲得 WP1成熟肽編碼區(qū),擴(kuò)增體系及PCR反應(yīng)程序同 1.2。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后連入pET-21a和 pET-28a表達(dá)載體,用NdeⅠ和EcoRⅠ從pMal- c2x將MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)編碼區(qū)切出并連入 pET-21a載體,最終獲得融合表達(dá)載體pET-21a- MBP-WP1和pET-28a-His6-WP1。分別將表達(dá)載 體導(dǎo)入大腸桿菌T7 Expression菌株,37℃培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)誘 導(dǎo)6 h后收集菌體。用低鹽緩沖液(10 mmol/L Tirs-HCl(pH7.6)、50 mmol/L NaCl)重懸菌體,超 聲破碎細(xì)胞,4℃、12 000 r/min離心。將離心后的 上清液載入Amylose親和層析柱,依次用5倍柱體 積低鹽緩沖液、5倍柱體積高鹽緩沖液(10 mmol/L Tirs-HCl(pH7.6)、300 mmol/L NaCl)、5倍柱體積 低鹽緩沖液洗柱,最后用洗脫緩沖液(含5 g/L麥芽 糖)洗脫,獲得MBP-WP1融合蛋白。使用100~ 200 g/L SDS-PAGE檢測(cè)總蛋白和純化后的蛋白, 使用Bio-Rad公司的quantity one軟件分析目的蛋 白的表達(dá)量。
1.5 過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)
用ABTS法檢測(cè)融合蛋白的過(guò)氧化物酶活 性[9]。取5μL(1 mg/mL)純化的融合蛋白,加入到 100μL反應(yīng)緩沖液中,其中含有2. 5 mmol/L ABTS、2 mmol/L H2O2、5 mmol/L CaCl2、50 mmol/L pH4.0的HAc-NaAc。用SpectraMax M5 測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物在405 nm的吸光度值(A405)。
2 結(jié)果與分析
2.1 小麥wp1的cDNA克隆
以“中國(guó)春”小麥開(kāi)花后12 d的籽粒為材料,提 取總RNA,從總RNA的電泳結(jié)果中可以清晰地分 辨出28,18和5.8 S rRNA對(duì)應(yīng)條帶(圖1A);以 OligoT18為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA第一鏈,然 后使用引物P1/P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得大小為 1 100 bp左右的預(yù)期片段(圖1B)。測(cè)序結(jié)果表明, 該片段與最初EST拼接結(jié)果一致,包含了小麥wp1 完整的開(kāi)放閱讀框,該閱讀框編碼358個(gè)氨基酸殘 基的前體蛋白,推導(dǎo)的蛋白序列與此前本實(shí)驗(yàn)室純 化獲得的WP1質(zhì)譜分析結(jié)果一致。
2.2 小麥WP1的序列分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用NCBI的BlastP進(jìn)行序列相似性搜索,結(jié) 果發(fā)現(xiàn),小麥WP1與大麥種子特異表達(dá)過(guò)氧化物酶 BP1及水稻類過(guò)氧化物酶Os01g0963200高度相 似,序列的一致度分別為89%和70%,它們同屬植 物過(guò)氧化物酶超家族成員。從多序列比對(duì)結(jié)果(圖 2)可以看出,以上3種酶序列在N-末端信號(hào)肽區(qū)保 守度較低,但在血紅素結(jié)合位點(diǎn)、鈣離子結(jié)合位點(diǎn)及 活性中心對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基高度保守。圖3為使用 Swiss-Model預(yù)測(cè)的小麥WP1和大麥BP1空間結(jié) 構(gòu)(PDB ID:1BGP),從結(jié)構(gòu)圖上可以清楚地看到血 紅素結(jié)合位點(diǎn)和鈣離子結(jié)合位點(diǎn),以及WP1和BP1 在空間結(jié)構(gòu)上的高度保守性。
2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
將WP1成熟肽編碼區(qū)與MBP和His-Tag編 碼序列融合,構(gòu)建了pET-21a-MBP-WP1和pET- 28a-His6-WP1融合表達(dá)載體,載體結(jié)構(gòu)如圖4A所 示,載體的酶切鑒定結(jié)果如圖4B所示。將融合表 達(dá)載體導(dǎo)入T7 Expression大腸桿菌菌株進(jìn)行誘導(dǎo) 表達(dá),結(jié)果如圖5A所示。從圖5A可以看出,His- Tag融合的WP1主要以包涵體形式存在,而MBP 融合的WP1主要以可溶形式存在,表達(dá)量分別達(dá)到 總蛋白的18.2%和34.6%。采用Amylose柱對(duì) MBP融合的WP1進(jìn)行純化,獲得單點(diǎn)純化的融合 蛋白MBP-WP1(圖5B)。
2.4 融合蛋白MBP-WP1過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè) 以ABTS為底物檢測(cè)MBP-WP1融合蛋白的 過(guò)氧化物酶活性,圖6反映了不同反應(yīng)條件下溶液 在405 nm處吸光度的變化。從圖6可以看出,加入 Ca2+和不加入Ca2+的對(duì)照樣品的吸光度值基本一 致,且變化幅度都非常小;加入融合蛋白后吸光度值 有小幅上升,但同時(shí)加入Ca2+和融合蛋白WP1后 吸光度值有明顯上升。因而MBP融合的WP1有 微弱的過(guò)氧化物酶活性,且Ca2+對(duì)其有強(qiáng)的激活作 用。
3 討 論
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,基因克隆已變得越來(lái)越 容易,但對(duì)于某些特定基因,PCR擴(kuò)增仍然會(huì)遇到 不小的難題,比如高GC含量基因和包含重復(fù)序列 的區(qū)段。本研究初期曾使用過(guò)多種DNA聚合酶進(jìn) 行擴(kuò)增,但均無(wú)結(jié)果,甚至從克隆載體中擴(kuò)增不到條 帶;分析小麥wp1的cDNA序列后發(fā)現(xiàn),該基因平 均GC含量為71%,局部區(qū)域GC含量在76%以上。 參考文獻(xiàn)[10]后,在PCR體系中加入終濃度1 mol/L的甜菜堿和80 g/L的DMSO,結(jié)果獲得了較 好的擴(kuò)增效果。DMSO可有效降低模板的解鏈溫 度;甜菜堿有類似功效,且可抑制非特異擴(kuò)增,增強(qiáng) 長(zhǎng)片段擴(kuò)張,保護(hù)聚合酶的催化活性。
利用大腸桿菌表達(dá)植物過(guò)氧化物酶的報(bào)道并不 多見(jiàn)[2,11-12],使用大腸桿菌表達(dá)小麥過(guò)氧化物酶的 研究未見(jiàn)報(bào)道。已有的幾篇報(bào)道中,目的蛋白主要 以包涵體形式存在,通過(guò)變性復(fù)性獲得部分活性,然 后使用各種方法將活性蛋白和非活性蛋白分開(kāi)。在 本研究中,關(guān)于His-Tag融合的WP1與前人研究結(jié) 果類似,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在;而MBP 融合的WP1主要以可溶蛋白形式存在,降低溫度, 延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間,能提高可溶蛋白所占的比例。MBP 融合的WP1雖然以可溶形式存在,但只能檢測(cè)到微 弱活性,說(shuō)明融合蛋白雖然可溶,但絕大部分仍未能 正確折疊,在后續(xù)研究中可通過(guò)增加分子伴侶、二硫 鍵異構(gòu)、在培養(yǎng)基中添加外源血紅素等措施,提高酶 蛋白的正確折疊,提高酶的比活力。本研究中,融合 蛋白WP1的活性受鈣離子激活,這與Converso 等[13]的研究結(jié)果一致。從本研究預(yù)測(cè)的空間結(jié)構(gòu) 可以看出,小麥WP1具有類似大麥BP1的兩個(gè)鈣 離子結(jié)合位點(diǎn),Ca2+對(duì)融合蛋白有激活作用,說(shuō)明有 少量融合蛋白能正確折疊成活性形式。 小麥種子過(guò)氧化物酶WP1在種子發(fā)育過(guò)程中 表達(dá),在成熟種子中有一定累積。對(duì)WP1具體的組 織學(xué)定位及在種子發(fā)育過(guò)程中的具體功能尚不清 楚;在面粉工業(yè)中,有研究者通過(guò)添加辣根過(guò)氧化物 酶、葡萄糖氧化酶、脂過(guò)氧化物酶等外源酶改變面粉 加工性能, WP1作為面粉中主要的內(nèi)源過(guò)氧化物 酶,其對(duì)面粉的加工性能有何影響,上述問(wèn)題將是下 一步研究的重點(diǎn)。
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