香莢蘭豆為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭 Vanilla planifoli Andrews 的成熟果實(shí)，具有息風(fēng)止痙、鎮(zhèn)靜抗驚等功效。 現(xiàn)代研究表明， 其主要化學(xué)成分為香蘭素，具有鎮(zhèn)靜和抗驚厥的作用，臨床上用于治療癲癇痛療效顯著。不僅如此，香莢蘭豆還是重要的香原料，其獨(dú)特的香型使其成為食品、飲料、化妝品等產(chǎn)品中的主要配香原料，國內(nèi)使用的香莢蘭豆藥材原料主要來源于馬達(dá)加斯加，但香莢蘭豆尚未被中國藥典收載，國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)香莢蘭豆原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的研究報(bào)道較少。 本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)香莢蘭豆指紋圖譜進(jìn)行了研究， 并通過《中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件》計(jì)算分析比較，為完善香莢蘭豆原料的評(píng)價(jià)體系和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料
1.1 儀器 DIONEX-ULTIMATE 3000 高效液相色譜儀， Agilent ZORBAX SB-C18 （250mm×4.6mm，5μ m）色譜柱； UP5200H 超聲波清洗器（熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司）； Sartorius CP225D電子分析天平（d=0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司）。
1.2 試藥 香莢蘭豆由武漢黃鶴樓香精香料有限公司提供，藥材來源于馬達(dá)加斯加阿諾那香莢蘭公司（批號(hào)分別為 100101，100302，100403，100604，100705，100906，101107，101208，110109，110310），經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭 Vanilla planifolia Andrews 的成熟果實(shí)；香蘭素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào) 100491-200901，純度 99.0%） ；對(duì)羥基苯甲酸，香草酸，對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品（邁舒上海 ELISA 生物技術(shù)研究所，批號(hào)分別為 583-43-8， 530-57-4， 641-73-7， 純度分別為 99.0%、98.5%、99.0%） ；甲醇為色譜純（美國天地公司）；其他所用試劑均為分析純；水為純化水。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜柱 Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m），以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫；流速為 0.8 ml﹒min-1；柱溫為 30 ℃；檢測波長為 254 nm；供試品進(jìn)樣量10 μ l；參照物進(jìn)樣量 10 μ l；分析時(shí)間：45 min。
2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取香蘭素，對(duì)羥基苯甲酸，香草酸，對(duì)羥基苯甲醛對(duì)照品適量，精密稱定，加 75%乙醇溶液制成每 1 ml 含 50 μ g 的溶液，即得對(duì)照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備 取香莢蘭豆原料約 1 g，剪碎，精密稱定，精密加入 8 倍量的 75%乙醇溶液，閉塞，稱定重量，超聲提取，再稱定重量，用 75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液 0.5 ml 至 100 ml 量瓶中，加 75%乙醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μ m）過濾，即得供試品溶液。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液 10 μ l，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 5 次， 以香蘭素峰作為參照峰，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。 結(jié)果表明對(duì)羥基苯甲酸，香草酸，對(duì)羥基苯甲醛各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD 分別為 0.14%、0.23%、0.25%，均小于 1%。相對(duì)峰面積 RSD 分別為 1.16%、1.03%、1.15%，均小于 1.5%，采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度大于 0.95，結(jié)果表明，儀器的精密度良好。
2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一香莢蘭豆供試品溶液，按 2.1 項(xiàng)下的色譜條件，分別在 0，2，4，8，16，24，36 h 進(jìn)行檢測，以香蘭素峰作為參照峰，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD 為 0.37%，0.25%， 0.34%，均小于 1%。 相對(duì)峰面積 RSD 為 1.34%， 1.01%，1.15%，均小于 1.5%。 采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度大于 0.95，結(jié)果表明，供試品溶液在 36 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批香莢蘭豆原料樣品 5 份，每份約 1 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間 RSD 為 0.33%、 0.27%、 0.33%， 均小于 1%。 相對(duì)峰面積 RSD 為 0.91%、 0.56%、1.27%， 均小于 1.5%。采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度大于 0.93，表明本方法重復(fù)性良好。
3 討論
3.1 提取方法的選擇 香莢蘭豆中的主要特征性成分為香蘭素。本試驗(yàn)通過對(duì)不同提取溶媒、提取方法進(jìn)行試驗(yàn)考察，結(jié)果表明 75%乙醇提取率最高，超聲法比冷浸法的提取方法簡便、且提取效率高。按擬定的供試品溶液的制備方法操作，測定的指紋圖譜色譜峰分離度大于 1.5。
3.2 流動(dòng)相選擇 根據(jù)參考文獻(xiàn) 2 的色譜條件，對(duì)樣品進(jìn)行分離，分離效果不佳。在此基礎(chǔ)上調(diào)整梯度，最終確定了文中所述流動(dòng)相，可以在保證分離效果的基礎(chǔ)上，較大程度縮短分析時(shí)間。在此色譜條件下，羥基苯甲酸，香草酸，對(duì)羥基苯甲醛、香蘭素分離效果良好。
本文通過 DAD 檢測器在 190～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，考察所測物質(zhì)紫外吸收，根據(jù) 4 種成分的紫外吸收特性，選取 275 nm 作為檢測波長，保證各成分在選定流動(dòng)相體系中均有較大吸收。
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