藻毒素類物質是富營養(yǎng)化水體中最為典型的有毒環(huán)境有機污染物之一，尤其隨著全球溫室效應加劇，有毒藍藻水華現(xiàn)象頻繁發(fā)生，造成微囊藻毒素等產毒藍染加劇。微囊藻水華樣品提取物能夠誘導人淋巴細胞凋亡，此后又有大量試驗證明MCs能夠誘導淋巴細胞功能下降。在自然水體中，污染物往往不是單一成分而是多種污染物共存，所以復合污染的毒效應問題成為毒理學關注的熱點之一。微囊藻毒素中的MC-LR能夠與其它污染物復合作用對水生生物產生影響。MCs 會與消毒副產物CHClBr2 及CHCl2Br 復合誘導魚淋巴細胞凋亡，而Lindsay等研究發(fā)現(xiàn)藍藻脂多糖)可以降低藻毒素對水蚤(Daphnia spp.)及豐年蟲(Artemia salina)的毒性，其LC50分別從2 和1.26 μg?mL-1(單一暴露MC-LR)升至4.9 和4.6μg?mL-1(復合暴露)。
1 材料 供試鯰魚購自某養(yǎng)殖基地，每尾體長(30±5) cm，體質量(600±10) g，行動活潑、魚鰭完整舒展，健康。實驗室馴養(yǎng)一周后進行試驗。
2 供試儀器 Sigma 高速冷凍離心機、細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫水浴箱、Guava easyCyte 8HT 流式細胞儀、環(huán)境掃描電鏡、凝膠成像系統(tǒng)、酶標儀、分光光度計、熒光定量PCR 儀、超聲波細胞破碎儀和Chrom 4TM 檢測器。
3 鯰魚淋巴細胞的分離與培養(yǎng)
在無菌室取出健康鯰魚頭腎，置于預冷的PBS 緩沖液中用眼科剪剪碎，過100 目不銹鋼細胞網(wǎng)篩，應用淋巴細胞分離液，5000r·min-1 離心30 min 分離得淋巴細胞，收集的細胞用PBS 洗3 次后置于RPMI1640 培養(yǎng)液(含10%新生小牛血清)中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱的溫度保持在27 ℃。為排除單核細胞等的干擾，在27 ℃培養(yǎng)2~3 h 后收集上清液，1500 r?min-1 離心10 min，細胞加新鮮培養(yǎng)基(含10%新生小牛血清、100 μg?mL-1 青霉素和100 μg?mL-1 鏈霉素)重懸，待用。細胞密度控制在1×106 cells?mL-1。
4 細胞周期和凋亡率
將培養(yǎng)2h 的鯰魚淋巴細胞離心收集(3000 r·min-1，5 min)，然后用4℃預冷PBS 清洗2次，最后在70 %乙醇冰浴過夜。在上機前需在40μm 細胞網(wǎng)篩上過濾，并用100 mg?L-1RNase(Sigma)和50 mg?L-1PI(碘化丙啶，Sigma)緩沖液在室溫避光孵育30min，Guava easyCyte 8HT 流式細胞儀(Merck Millipore,Darmstadt, Germany)模塊檢測細胞凋亡率，分析DNA 含量和細胞周期，得出細胞各周期的百分率。檢測激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長630 nm
5 數(shù)據(jù)處理
試驗數(shù)據(jù)使用Origin 統(tǒng)計軟件(8.0 版)進行處理，采用單側ANOVA(Student)法進行差異顯著性檢驗(ɑ=0.01)。數(shù)據(jù)結果以平均數(shù)±標準偏差(mean±SD)表示。
6 結果
GST 作為一種細胞質中的超級多功能蛋白，能夠降低內源性及外援性化合物毒性。其解毒功能主要是通過催化谷胱甘肽(GSH)的巰基(-SH)結合到疏水化合物上, 使親脂化合物變成親水物質, 然后通過膽汁或尿液排泄。同時， MC-LR 能通過與GSH 結合降低毒性(MC-LR: LD50=38 μg?kg-1；MCLR-GSH: LD50=630 μg?kg-1；小型鼠)。
此外，研究證明β-GSTs 中的一種變形酶同樣具有結合活性，并且有具有氧化還原活性的二硫鍵。LPS 與MC-LR 的復合毒性加劇了GST 的減少，導致魚淋巴細胞內GSH 以及GST 的解毒能力降低，凋亡率增加。GST 除了通過直接結合MC-LR 達到解毒作用外，還可通過減少細胞內氧化自由基數(shù)量起到調節(jié)氧化應激的作用。
研究表明，LPS 與MC-LR 復合會引起繼發(fā)性魚免疫毒性，該結果與Lindsay 等的研究結果相左。主要原因為在于：
1）LPS來源不同。本試驗采用的是細菌中的LPS，而Lindsay等所用LPS為藍藻提取。LPS本身結構繁多，不同結構下其毒性存在較大差異。相較于細菌中LPS，藍藻中LPS 缺少磷酸根，但具有更多不同種類的不飽和脂肪酸長鏈以及羥基脂肪酸，此外結構主架中KDO(2-酮基-3-脫氫辛酸)、半乳糖、七碳糖數(shù)量也各不相同。
2)試驗對象及誘導方式不同。本試驗采用魚淋巴細胞體外誘導方法，而Lindsay 等的試驗對象為水蚤(Daphnia spp.)及豐年蟲(Artemia salina)，并進行體內誘導。相對體內誘導，體外染毒對象更專一，效果更顯著。
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