1材料與方法
(1)菌種
帶小棒鏈霉菌(Streptomycesclavuli-gerus)XC-1-35，系浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠保藏菌株。
(2)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
斜面及平板培養(yǎng)采用高氏1號(hào)培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)8～9d。
種子培養(yǎng)250ml三角瓶裝30ml培養(yǎng)基，置旋轉(zhuǎn)式搖床28℃，220r/min振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基成分(g/L)：可溶性淀粉15，甘油15，魚粉20，CaCO33，pH6.5～7.0。
搖瓶發(fā)酵250ml三角瓶裝30ml培養(yǎng)基，接種量10%，28℃，220r/min振蕩培養(yǎng)96h。培養(yǎng)基成分(g/L)：淀粉50，甘油5，黃豆粉30，玉米漿5，CaCl20.1，NaCl0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O0.1，MgCl2·6H2O0.1，KH2PO40.8，CaCO33，pH6.5～7.0。
(3)分析方法
克拉維酸含量測(cè)定發(fā)酵液采用6mol/L鹽酸調(diào)pH至3.5～4.0，3500r/min離心10min，去除菌絲體和固體殘?jiān)?ml上清液，12000r/min離心10min后，用重蒸水適當(dāng)稀釋，供HPLC檢測(cè)。色譜條件為：色譜柱C18，ODS(4.6mm×150mm)，柱溫25℃。檢測(cè)器：VWD(SPD-10A)，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，流動(dòng)相：0.02molKH2PO4∶乙腈(400∶12，體積比)，流速0.7ml/min，進(jìn)樣量10μl。
菌絲濃度測(cè)定取10ml發(fā)酵液，4000r/min離心15min，測(cè)得沉淀物在發(fā)酵液中所占的比例即為菌絲濃度。pH測(cè)定pH電極測(cè)定。
(4)菌種誘變處理
單孢子懸液的制備將冷凍孢子移種子斜面，培養(yǎng)成熟后加入500μg/ml的無(wú)菌咖啡因溶液(作助變劑)，刮下孢子并打散，用無(wú)菌濾紙過(guò)濾即得。
誘變處理吸取5ml單孢子懸液于無(wú)菌平板中，置于功率為30W，波長(zhǎng)253.7nm的紫外燈直下30cm處開蓋振蕩照射60s，避光放置過(guò)夜，取樣經(jīng)梯度稀釋后涂平板，28℃，避光培養(yǎng)9d左右，挑取單菌落轉(zhuǎn)接斜面。
(5)甘油耐受性突變株的篩選
將經(jīng)紫外線照射的孢子懸液稀釋后，分別涂布于含有一定甘油濃度的分離平板上，28℃培養(yǎng)9～12d。
2結(jié)果與討
2.1甘油耐受性突變株的篩選
帶小棒鏈霉菌存在著甘油誘導(dǎo)的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(GTS)，在甘油耐受性高的菌株中GTS活力強(qiáng)，可高效轉(zhuǎn)運(yùn)甘油合成克拉維酸。為此，試驗(yàn)中采用耐受高濃度甘油的平板篩選UV誘變后的突變株。
(1)菌株XC-1-35對(duì)甘油的耐受性考察
分別將未誘變處理和經(jīng)UV誘變處理后的XC-1-35菌株的單孢子懸液，采用梯度稀釋后涂布于含不同濃度甘油的分離平板上，結(jié)果如研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的對(duì)照組在含12%以上甘油濃度的平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，其甘油耐受濃度為10%；經(jīng)UV誘變處理的誘變組在含14%甘油濃度的平板上還可生長(zhǎng)出少量呈光禿型的小菌落，并且隨著平板中甘油濃度的增加，菌落的生長(zhǎng)速度也隨之減慢，其培養(yǎng)時(shí)間由對(duì)照的9d延長(zhǎng)到13d。
(2)甘油耐受性突變株的選育
將經(jīng)UV誘變處理60s后的XC-1-35單孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布在含14%甘油濃度的分離平板上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選耐高甘油濃度突變株，共挑取了93支耐受菌株轉(zhuǎn)接斜面。搖瓶發(fā)酵初篩及復(fù)篩結(jié)果表明，采用篩選甘油耐受性突變株的選育效果比較理想，正變率達(dá)到63.3%，負(fù)變率僅為3.3%。利用該抗性突變株篩選方法，試驗(yàn)中共進(jìn)行了5輪的菌種選育，得到高產(chǎn)菌株XC-5-48的效價(jià)達(dá)1970μg/ml，為出發(fā)菌株(318μg/ml)的6.2倍。該誘變株經(jīng)斜面連續(xù)傳代4次，發(fā)酵效價(jià)穩(wěn)定在1800μg/ml以上，表明其高產(chǎn)性能穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步的對(duì)照組和誘變組的甘油耐受濃度比較驗(yàn)。
2.2突變株XC-5-48與出發(fā)菌株XC-1-35的生理特性研究
Miuambres等認(rèn)為克拉維酸產(chǎn)生菌中具有兩種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)甘油分子系統(tǒng)。其中透過(guò)細(xì)胞90%以上的甘油是由甘油轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(GTS)轉(zhuǎn)運(yùn)的。GTS是一種分布于細(xì)胞膜上的透性酶(轉(zhuǎn)運(yùn)酶系)，酶活性的最適pH為7.0，最適溫度為23～35℃，Km為14μmol/L，半衰期為8h左右。該透性酶的活性中心含有-SH基團(tuán)，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整程度相關(guān)，并受到L-絲氨酸等某些物質(zhì)的抑制。為此，試驗(yàn)中通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的影響GTS系統(tǒng)活性的因素，如絲氨酸、碘乙酸、脂肪酸，分別觀察其對(duì)突變株XC-5-48與出發(fā)菌株XC-1-35的生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)物合成的影響，以了解突變株的生理特性。
