分離時(shí)選擇了合適的蛋白柱，有時(shí)往往不能成功地完成蛋白的分離，同一根蛋白分離柱在不同的使用者手中可能會(huì)有不同的柱壽命及分離效果，正確的使用蛋白柱和正確的日常維護(hù)是保證成功分離蛋白及延長柱壽命的關(guān)鍵。
不論使用什么類型的蛋白柱，首先必須對(duì)其填料的性能有基本了解。如該柱適用什么樣的溶劑，什么類型的樣品，流速及耐壓范圍等，GAT提供的各種類型的蛋白柱，在柱箱內(nèi)均有詳細(xì)的說明書，使用柱子前，務(wù)必要仔細(xì)閱讀，以保證正確使用這些柱子。下面就蛋白分離中常出現(xiàn)的問題進(jìn)行討論。
①樣品不保留：
在用離子交換柱分離蛋白時(shí)，流動(dòng)相的pH值對(duì)保留值影響很大，當(dāng)選用陰離子型蛋白分析柱時(shí)，如若流動(dòng)相的pH值小于蛋白的pI值時(shí)，蛋白分子陽離子狀態(tài)，則在柱上沒有保留，只有當(dāng)流動(dòng)相的pH值大于蛋白的pI值時(shí)，蛋白分子呈陰離子，才能在陰離子交換柱上得到保留。另外，當(dāng)流動(dòng)相或樣品中的離子強(qiáng)度過大時(shí)，也會(huì)造成蛋白在離子交換柱上不保留。
此外，上樣量過大，亦會(huì)使蛋白樣品保留變?nèi)?，一般樣品的上樣量不?yīng)超過該填料結(jié)合蛋白量的20%，在選用GPC柱時(shí)，應(yīng)特別注意填料的孔徑及相應(yīng)的可分離蛋白的分子量范圍，若蛋白的分子量超過填料的孔徑極限則蛋白樣品也不保留。
在用反相色譜分離蛋白時(shí)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例會(huì)影響蛋白的保留值。有機(jī)溶劑比例過高，會(huì)使蛋白的樣品與填料的作用變?nèi)醵^早地洗脫。流動(dòng)相中的三氟乙酸可作為離子對(duì)試劑和pH調(diào)節(jié)劑，有利于蛋白的保留。
②回收率（質(zhì)量回收率）低
蛋白質(zhì)量回收率低往往發(fā)生在使用凝膠過濾柱時(shí)，特別是以硅膠為基質(zhì)的凝膠蛋白分析柱時(shí)，盡管硅醇基已經(jīng)過雙醇封口，但殘留的硅醇基仍會(huì)與蛋白的堿性基團(tuán)發(fā)生非GFC效應(yīng)，造成回收率低，分離度差等現(xiàn)象,解決這一現(xiàn)象的方法是在流動(dòng)相（通常是水）中加入0。M-0。3M鹽作為改性劑以減少這種非GFC效應(yīng)。
③柱壓過高
柱壓過高的原因在于柱入口的堵塞及填料間的縫隙的減小或堵死，這些原因有：非硅膠填料的顆粒膨脹（主要是由于使用過高比例有機(jī)溶劑引起）；來自樣品，流動(dòng)相的顆粒堵塞、細(xì)菌生長，流速過高等，為防止柱壓過高，應(yīng)使用符合要求的流動(dòng)相組成。樣品，流動(dòng)相使用前嚴(yán)格過濾。為了保存時(shí)防止細(xì)菌生長。以硅膠為基質(zhì)的柱子可使用20%有機(jī)水溶液保存。其它柱子在保存液中加入0。02%的疊氨鈉。
④性能改變
蛋白柱在使用一段時(shí)間后，其性能會(huì)有所改變（保留值變化，柱效下降等）。原因之一是被分離樣品中細(xì)胞碎片，類脂，酸等的污染，對(duì)聚合物基質(zhì)的柱子可用0。1-1。0N NaOH溶液清洗，注意以硅膠為基質(zhì)的柱子（如Protein Pak凝膠柱）不能用NaOH清洗。
