分類學(xué)是區(qū)分有機體的種類并將之分類的理論和實踐；系統(tǒng)學(xué)(Systematics)是關(guān)于生物分類、生物多樣性以及生物間親緣關(guān)系的研究。Charles(1970)進一步厘清系統(tǒng)學(xué)和生物分類學(xué)的關(guān)系為：系統(tǒng)學(xué)的領(lǐng)域包括(a)提供生物的科學(xué)名稱，(b)描述生物，(c)保存被命名和描述的生物的標(biāo)本，(d)確定生物分類地位、分類檢索特征和分布數(shù)據(jù)，(e)研究生物的進化史，(f)考慮生物的環(huán)境適應(yīng)：兩個學(xué)科歷史悠久但近年來混淆不清的主要原因是所涵蓋的內(nèi)容；(e)和(f)與進化有關(guān)，其他則屬于分類問題；考慮上述(a)一(d)因素，生物分類學(xué)屬于系統(tǒng)生物學(xué)的一部分。Mayr認為，由于生物物種數(shù)量龐大，雖然形態(tài)分類只是以少數(shù)可分辨的成對性狀為基礎(chǔ)，但分類學(xué)仍然是整個系統(tǒng)學(xué)的主干和基礎(chǔ)；早期分類主要強調(diào)檢索表的制作，現(xiàn)在分類著重于為信息貯存和信息檢索系統(tǒng)構(gòu)建索引。全球分類學(xué)倡議(GTI)則規(guī)定，根據(jù)廣義的理解，生物分類是指生物類別的劃分，但這門學(xué)科通常側(cè)重的是對物種、物種的遺傳變異性以及物種之間的關(guān)系進行描述；就生物多樣性公約實踐應(yīng)用來說，對生物分類的理解是最廣義的，其中包括遺傳、物種和生態(tài)系統(tǒng)層面上的系統(tǒng)學(xué)和生物系統(tǒng)學(xué)。[1]
分類學(xué)的概念一直在發(fā)展中，由于生物演化是無法完全模擬的已發(fā)生事實，因而系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法有多種手段來分析、評估和推測生物間的親緣關(guān)系，分類學(xué)概念因此多年來難以統(tǒng)一。即使是廣義的分類法，不同學(xué)術(shù)領(lǐng)域的理解和定義也不一致。GenBank應(yīng)用了‘'NCBI Taxonomy'’一詞，試圖以林奈物種系統(tǒng)來對分子數(shù)據(jù)進行歸類，然而Taxonomy的用詞嚴謹性遭到非議；生物信息學(xué)(Bioinformatics)一詞原本包括基因、物種和生態(tài)系三個不同層次的所有生物數(shù)據(jù)，但此概念一度成為研究基因數(shù)據(jù)庫的代名詞，Costcllo等對這種認識上的偏頗進行了校正，從基因、物種、種群三個層面上厘清了生物信息學(xué)和生態(tài)信息學(xué)(Ecoinformatics)、親緣信息學(xué)(Phyloinformatics)、物種信息學(xué)(SpeciesInformatics)、生態(tài)信息學(xué)(Ecoinformatics)以及地理信息學(xué)之間的關(guān)系。[2]而對魚類種群的鑒別運用到生物信息學(xué)，這也就把分子生物學(xué)技術(shù)運用到了水產(chǎn)上。
臺灣大學(xué)漁業(yè)科學(xué)研究所蔡懷禎教授等, 應(yīng)用生物技術(shù)不僅能讓魚變性, 還能在飼料中添加含魚類生長蛋白質(zhì)基因的酵母, 加快魚的生長。還可用精子為媒介, 將外來的生長蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)殖到卵內(nèi), 培育出一種快速生長的改良種。前一種方法只能讓1 代魚長的快, 而后一方法則是基因改良, 而且可以世代繁殖的新品系。目前, 他們已研制成功的有轉(zhuǎn)基因泥鰍與九孔, 成功率超過50 %?；蜣D(zhuǎn)殖處理的泥鰍比不處理的泥鰍在6 個月內(nèi)的生長速度要快2.5 倍到4 倍, 特別是九孔, 已開發(fā)出成長快2 倍的新品系。他們用生長蛋白質(zhì)基因加速生長成功的魚類有吳郭魚(南洋卿)、烏魚、黃鰭細和黑綱。此種魚類食用安全, 口感有待評估。
分子生物學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體檢測中的應(yīng)用
目前, 我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤其是蝦類、貝類和魚類養(yǎng)殖業(yè)受到病原微生物的嚴重影響, 因此如何快速準(zhǔn)確預(yù)報和診斷水產(chǎn)動植物疾病, 就成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)十分重要而突出的問題。進些年來, 分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 已經(jīng)有可能為水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的檢測提供快速有效而且特異性強靈敏度高的技術(shù)手段。
單克隆抗體技術(shù)
單克隆抗體技術(shù)是Kohler 和Milstein[3]于1975 年發(fā)展起來的利用雜交瘤細胞制備大量針對某一抗原決定簇的特異性抗體的技術(shù)。單克隆抗體與常規(guī)血清抗體相比, 特異性強, 能識別單一抗原決定簇, 且容易制備, 能通過保持細胞系重復(fù)獲得相同抗體, 因而在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體檢測中得到廣泛應(yīng)用。如應(yīng)用于診斷海灣扇貝( Argopecten irradians )的鰓立克次體、診斷與魚類及牡蠣相結(jié)合的淋巴細胞病毒、檢測菲律賓蛤仔棕環(huán)病病因弧菌P1。另外, 近年來已有人利用此技術(shù)制備了抗鰻弧菌的單克隆抗體和抗嗜水單胞菌外毒素的單克隆抗體。據(jù)陳瓊等1996 年報道, 利用該技術(shù)制備的單克隆抗體可用于提純嗜水氣單胞菌hec 毒素。
酶聯(lián)免疫吸附檢測
酶聯(lián)免疫吸附檢測( ELISA) [4]是將抗原或抗體吸附在固相載體表面, 使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行的一種檢測技術(shù)。該技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化作用有機地結(jié)合起來, 通過酶作用于底物后呈現(xiàn)的顏色變化來顯示抗原抗體特異反應(yīng)的存在, 因此特異性強, 靈敏度高, 反應(yīng)快速, 結(jié)果可以定量, 也可對抗原、抗體以及抗原抗體復(fù)合物進行定位分析。目前ELISA 法在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體診斷尤其在魚病學(xué)診斷上應(yīng)用較廣。國內(nèi)如錢冬等1993 年用該法檢測細菌性敗血癥病原) ) ) 嗜水氣單胞菌, 陳懷青等。1993 年應(yīng)用Do-t ELISA 法檢測魚類致病性嗜水氣單胞菌hec 毒素, 黃等1995 年利用單克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測對蝦皮下造血組織壞死病病毒, 李煥榮等1997 年應(yīng)用Do-t ELISA 法快速檢測嗜水氣單胞菌的致病因子胞外蛋白酶Ah ECPase54, 均取得較為滿意的效果。國外則較早用ELISA 法對癤瘡病、紅嘴病、細菌性腎臟病和愛德華氏菌病等魚類疾病進行快速診斷。另外, Noel [5]等利用該法鑒定導(dǎo)致菲律賓蛤仔患棕環(huán)病的弧菌P1。
核酸雜交技術(shù)
核酸雜交技術(shù)是利用特定標(biāo)記的DNA 或RNA 探針和病原體生物中的與探針互補的靶核苷酸序列進行雜交, 以此來確定宿主是否攜帶有病原體的一類分子生物學(xué)技術(shù), 可分為Southern 雜交Northern 雜交和核酸原位雜交[6]。該技術(shù)以其靈敏度高、特異性強和檢驗快速等優(yōu)點, 近年來在對蝦病毒等水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體檢測中倍受青睞。如Futo等、Hiney等1992 年將此技術(shù)用來診斷細菌性魚病, Comps等1996 年應(yīng)用地高辛標(biāo)記的RNA 探針檢測FEV 病毒在海洋魚類中的表達, Bruce 等1994 年利用地高辛標(biāo)記的DNA 探針檢測對蝦桿狀病毒。日本也有人利用地高辛標(biāo)記的DNA探針進行菌落雜交用于鰻弧菌的鑒定; 利用經(jīng)PCR合成的探針與神經(jīng)壞死病病毒DNA 進行雜交選擇親魚, 可有效防止病毒性神經(jīng)壞死癥( VNN) 的垂直感染。我國的研究人員針對1993 年以來導(dǎo)致我國養(yǎng)殖對蝦大規(guī)模死亡的病原)) ) 皮下及造血組織壞死桿狀病毒(HHNBV) 已研制出相應(yīng)的核酸探針, 用于檢測受該病毒感染的對蝦。
PCR 技術(shù)
PCR 技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR) 是體外酶促合成迅速擴增特異DNA 片段的一種方法。這項分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生雖僅數(shù)年, 卻以驚人的速度廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個領(lǐng)域。目前PCR 技術(shù)已用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體檢測的實際操作, 如Chang[7]等1993年利用PCR 技術(shù)首次成功地進行對蝦病毒的擴增, Wang 等1996 年用PCR 方法檢測對蝦桿狀病毒, 并獲得了預(yù)計的擴增產(chǎn)物。另外, 也有人應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測貝類腸道病毒以及水或水生生物體內(nèi)富集的病毒和細菌。除應(yīng)用于病原體檢測外, PCR 技術(shù)還與其他分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)用, 廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)其他諸多領(lǐng)域。如應(yīng)用于魚類生長激素基因、各種cDNA 分子的克隆; 應(yīng)用于檢測外源基因是否整合入轉(zhuǎn)基因魚基因組中; 應(yīng)用于制作多基因家族基因組探針以及魚類種群結(jié)構(gòu)的遺傳分析和種質(zhì)遺傳鑒定等。
用分子生物學(xué)技術(shù)分類有以下幾種方法。
1. 1 免疫學(xué)方法 由于免疫學(xué)的發(fā)展, 人們又用免疫學(xué)方法進行分類。但是, 這種方法具體操作煩瑣, 隨之被人們拋棄。
1. 2 同工酶電泳技術(shù) 這種技術(shù)可以定量估計種群和種間的遺傳變異程度。日本的Nakabo等利用該技術(shù)對東南亞海區(qū)鱸魚進行分析, 推翻了東亞地區(qū)只有一種鱸魚的說法。李思法等研究了魴屬團頭魴、三角魴及廣東魴種間遺傳關(guān)系及種內(nèi)遺傳差異, 確定了各個亞種之間的進化關(guān)系[ 8]。
1. 3 魚類DNA 指紋圖譜技術(shù) 它具有多位點,高變異和簡單的遺傳方式等特點。它在魚類系統(tǒng)進化和親緣關(guān)系鑒定方面被廣泛應(yīng)用, 特別是線粒體DNA ( mtDNA) 技術(shù)。mtDNA 具有種群內(nèi)穩(wěn)定性高, 分子量小, 演化速度快, 種間差異大, 母子遺傳等特點。一般用于物種、種群的遺傳物質(zhì)鑒定, 研究物種的進化關(guān)系和種群的鑒定。Avise等以mtDNA 用限制性長度多態(tài)性( RFLP) 技術(shù)分析了美洲鰻和歐洲鰻的產(chǎn)卵場, 否定了過去一直認為它們具有混合產(chǎn)卵場的說法; 江世貴等 用mtDNA 擴增出細胞色素b( cytb) 基因, 對4 種鯛科魚類進行了分類和系統(tǒng)進化研究, 得出了與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類不一樣的結(jié)論[9]。
1. 4 隨機擴增DNA 多態(tài)性( RAPD) 分析技術(shù)RAPD 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、遺傳育種學(xué)及生物系統(tǒng)分類與進化研究等方面。Dinesh等[ 5] 用RAPD 方法分析12 種魚的DNA 序列, 發(fā)現(xiàn)每一種魚RAPD 擴增產(chǎn)物的電泳圖譜都不一樣, 即有種的特異性。趙凱等用RAPD 技術(shù)對青海湖浮裸鯉、鯽魚、草魚進行研究后認為, 該技術(shù)適用于科的分類, 而亞種間的變異水平較高, 進行相似性分析比較困難。陳自明等用RAPD技術(shù)對特化等級裂腹魚類親緣關(guān)系進行研究, 認為對屬級及屬級以上分類單元適用, 但對一些遺傳差異較大的類群( 如裂腹魚) 會出現(xiàn)個體之間遺傳距離接近或達到100% 的情況, 不能用RAPD技術(shù)。李學(xué)英等應(yīng)用RAPD 技術(shù)對南方鯰和普通河鯰建立了RAPD 分子遺傳學(xué)標(biāo)記。
1. 5 短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性分析技術(shù)( STR 技術(shù)) 主要用于魚的種群關(guān)系和進化關(guān)系研究。Beashman等對紅大馬哈魚進行了研究, 認為用STR能夠區(qū)分不同地區(qū)的紅大馬哈魚種群。Harris等用STR 對淡水龍蝦進行了研究, 能夠區(qū)分不同地區(qū)的品種。Rex roadI II 等對鱈科魚類進行了研究, Landry 等對大西洋鮭進行了研究, 得到相同結(jié)果。
運用Hae Ⅲ/33.6、HaeⅢ/33.15、Hinf Ⅰ/33.6、Hinf Ⅰ/33.15 4種限制酶/探針組合對奧利亞羅非魚、美國尼羅羅非魚、沙市尼羅羅非魚三種群體羅非魚進行非放射性DNA指紋圖譜研究，結(jié)果表明在三種羅非魚群體中4種限制酶/探針組合都能產(chǎn)生具有種屬特異性和個體特異性的DNA指紋圖譜.Hae Ⅲ/33.6、HaeⅢ/33.15組合中奧利亞羅非魚特有的強陽性雜交圖帶可作為鑒別奧利亞羅非魚的分子遺傳標(biāo)記.4種限制酶/探針組合在奧利亞羅非魚、沙市尼羅羅非魚、美國尼羅羅非魚檢出的個體平均圖帶數(shù)分別為8.726、8.086和6.975.4種限制酶/探針組合在奧利亞羅非魚、沙市尼羅羅非魚、美國尼羅羅非魚檢出的多態(tài)性位點比例分別為62.95%、96.31%和85.26%.
DNA指紋圖譜的鑒別能力
運用4種酶/探針組合對3種群體羅非魚的研究表明，奧利亞羅非魚的指紋圖譜明顯地區(qū)別于尼羅羅非魚的指紋圖譜.說明DNA指紋圖譜具有種特異性，可以用來區(qū)分不同的種.用Hae Ⅲ/33.6、HaeⅢ/33.15組合對三種群體羅非魚研究時，奧利亞羅非魚群體呈現(xiàn)1條雜交信號極強的種群內(nèi)每個個體共享的圖帶，而這是尼羅羅非魚所沒有的，因此，這一圖帶完全可以作為鑒別奧利亞羅非魚的分子遺傳標(biāo)記.
參考文獻
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