固然作為一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，HPLC仍然存在著可能出錯(cuò)的地方，比如說壓力混亂、管道阻塞、和層析柱不能永遠(yuǎn)使用等題目。以下來自著名科學(xué)儀器設(shè)備制造公司W(wǎng)aters Corp和LCResources的專家提出的幾點(diǎn)HPLC優(yōu)化建議。
1.了解你要用的緩沖液
“人們總是為了對(duì)相同的處方做出了不同的解釋而給我支付昂貴的咨詢費(fèi)。”
--LCResources總裁TomJupille
HPLC依靠于分析物之間的微分均衡，固定相(填料),和活動(dòng)相(溶劑)。常規(guī)的活動(dòng)相一般由50%的乙腈加上50%，10mM，pH2.5的磷酸鉀緩沖液組成，至少有四種混合它們的方法：正確法、輕易法、錯(cuò)誤法和笨方法。
正確的方法應(yīng)該是：按照正確的比例混合10mM的磷酸和10mM的磷酸二氫鉀達(dá)到pH2.5。然后混與等體積的乙腈混合。這個(gè)過程需要天生標(biāo)準(zhǔn)的操縱流程，明確標(biāo)定緩沖液的配方和有效期等。
2.天天更換緩沖液
水活動(dòng)相有可能被細(xì)菌，模具和樣品殘留污染，這些污染的出現(xiàn)可能會(huì)升高系統(tǒng)的壓力和進(jìn)步檢測(cè)儀的檢測(cè)背景，當(dāng)然當(dāng)裝活動(dòng)相的瓶子底部出現(xiàn)混濁的時(shí)候可以很明顯的發(fā)現(xiàn)這些污染，但是當(dāng)這些污染以薄膜的形式存在于瓶底或者瓶壁則不輕易發(fā)現(xiàn)。因此要不天天更換操縱的緩沖液，要不確保層析方法中包含10%-15%的有機(jī)溶劑，減少污染。
3.防止分歧格樣品進(jìn)進(jìn)層析柱
“盡最大可能使分歧格的樣品闊別層析柱”
--FredHutchinsonCancerResearchCenter的蛋白質(zhì)組主管Jupille.PhilipGafken
要分離的樣品一定不能對(duì)層析柱產(chǎn)生傷害，研究職員在進(jìn)行分離之前需要考慮像：鹽是否會(huì)沉淀?往垢劑是否會(huì)包被或者損害填料等等這樣的題目，而且專家也建議將單純的蛋白沉淀步驟(從血漿中分離分析物的通用方法)轉(zhuǎn)換為固相或者液相提取。比如說，假如你想尋求有機(jī)藥物代謝物，你可以將樣品與有機(jī)溶劑混勻使所想要的化合物進(jìn)進(jìn)溶劑中，而將大量的雜質(zhì)留在水相中。
4.使用保護(hù)柱
保護(hù)柱或者預(yù)柱是指置于主分析柱前的一根短(0.5-2cm)，相對(duì)便宜的柱子。花大概80到400元購(gòu)置這樣一根保護(hù)柱可以明顯地延長(zhǎng)昂貴的分析柱的壽命。有研究職員在正常的環(huán)境下進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一根柱子可以進(jìn)行1，000-2，000次填注，而安置了保護(hù)柱之后，柱子可以進(jìn)行10，000次的填注之后仍未出現(xiàn)稍微的改變。而且保護(hù)柱的填料也應(yīng)該周期性的改變，大約每200-500次填注后更換一次--假如樣品較臟則應(yīng)該更頻繁更換。
5，不要讓填料保存在水緩沖液中
在包含活動(dòng)相的緩沖液還殘留在系統(tǒng)中的時(shí)候切勿封閉HPLC系統(tǒng)。這是由于溶劑可以蒸發(fā)，留下緩沖液結(jié)晶，終極導(dǎo)致內(nèi)部損傷填料，由此引起一些小毛病。專家們以為用不含溶劑的緩沖液沖洗HPLC系統(tǒng)或者從不封閉HPLC系統(tǒng)，這樣在其它條件一致的情況下可以延長(zhǎng)柱子壽命，另外把柱子放進(jìn)運(yùn)載溶劑(shippingsolvent)中保存(例如純乙腈)也可以延長(zhǎng)層析柱壽命--由于運(yùn)載溶劑對(duì)柱料的損傷最小。
6.確定“四周環(huán)境”是指什么
很多HPLC方法要求適合的環(huán)境溫度(ambienttemperature)，但總會(huì)碰到這樣的題目：這里的室溫指的是仲春的蒙特利爾還是七月的波多黎各呢?也就是說，實(shí)際上HPLC的工作溫度可以是為所欲為的-4°C到25°C之間的任意溫度。到底什么是合適的周遭環(huán)境，我們必須根據(jù)具體的情況來確定，這是由于色譜法依靠于分析物在固定相和活動(dòng)相之間的平衡進(jìn)行分離，而平衡當(dāng)然依靠于溫度，所以當(dāng)你改變溫度，平衡分布也會(huì)改變，保存時(shí)間改變，可能出現(xiàn)誤識(shí)別樣品峰。
7.天天檢查系統(tǒng)的壓力
固然正確值依靠于你所使用的方法，但條件是系統(tǒng)的壓力不能明顯的高于或者低于前一天的壓力，或者說不能不穩(wěn)定，比如2，000±10psi可能很不錯(cuò)，而1,500±700psi則不適合。研究職員需要經(jīng)常記錄壓力，當(dāng)然很多現(xiàn)代的HPLC系統(tǒng)具有記錄泵壓力數(shù)據(jù)的特性，這些數(shù)據(jù)在維修中起到不可估量的作用。比如說假如說有一天你忽然在一系列的運(yùn)轉(zhuǎn)中得到很多陰性結(jié)果。有可能是所想要的樣品峰偏離了它所對(duì)應(yīng)的保存時(shí)間區(qū)(retentiontime)，這個(gè)時(shí)候你要做的首要事情就是檢查泵壓力的記錄
8.不要在檢查接頭方面省事
不要忽略泄漏。隨著時(shí)間的積累這對(duì)于實(shí)驗(yàn)的影響更大，不僅僅是不方便的題目，滲漏使得保存時(shí)間的偏移，導(dǎo)致所想要的樣品峰延遲出現(xiàn)。專家的建議是：至少會(huì)將能見到的接頭都掃視一遍。假如你發(fā)現(xiàn)了滲漏現(xiàn)象，切斷接頭并替換。
9.一次只能更換一樣?xùn)|西
當(dāng)東西出現(xiàn)題目的時(shí)候，切忌一次性換完所有東西。在維修中，應(yīng)該從系統(tǒng)整體出發(fā)，因此不能一次更換預(yù)柱，溶劑，和檢測(cè)燈，而應(yīng)該每次只更換一樣?xùn)|西。
10.天天檢測(cè)
在你不知道HPLC的日常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下，你不可能對(duì)它進(jìn)行維修，所以專家建議天天對(duì)HPLC進(jìn)行檢測(cè)，收集相關(guān)的數(shù)據(jù)。
